本发明专利技术公开了一种重组长效人透明质酸酶，为人透明质酸酶PH20细胞外部分与人源蛋白（人白蛋白HSA片段或人免疫球蛋白IgG2Fc片段）的融合蛋白PH20-HSA或PH20-IgFc，其氨基酸序列分别如SEQ ID No.4或SEQ ID No.5所示，具有体内安全性高、半衰期长的优点；本发明专利技术还公开了上述重组长效人透明质酸酶的编码基因、表达载体、宿主细胞、生产方法及稳定制剂，使用富含GC高表达系统表达和中国地仓鼠细胞（CHO）生产可达到工业化水平和得到有活性能纯化的产物；本发明专利技术还公开了上述重组长效人透明质酸酶在配合给药及生产小分子透明质酸中的应用。
【技术实现步骤摘要】
-种重组长效人透明质酸酶、其编码基因、生产方法及应用
本专利技术主要涉及生物
，特别是涉及一种重组长效人透明质酸酶、其编码 基因、生产方法及应用。
技术介绍
透明质酸是真皮中主要的粘多糖形式，是由重复的二糖单元D-葡萄糖醛酸及 N-乙酰葡糖胺组成的线性多糖。透明质酸能够保持超过自身重量500倍的水分，形成非常 粘稠的溶液，填充在胞外基质胶原蛋白纤维骨架之内，影响胞外基质的传质特征。胞外基质 是许多药物进行皮下注射的主要障碍。胶原蛋白纤维构成的固态基架与嵌入富含透明质酸 的黏性凝胶，造成一定的传质阻力，限制了药物代谢动力学以及能够从同一位点进行皮下 注射的液体体积，以及到达血管的速度和数量。 透明质酸酶是降解透明质酸的酶家族，通过催化透明质酸的水解，透明质酸酶降 低透明质酸的黏度，可逆性地改变真皮的结构，由此提高组织的通透性。透明质酸酶半衰期 15_20h，在体内更新时间短，皮肤能够快速修复。基于透明质酸酶的打通胞外基质屏障给药 是一种新型高效给药平台。根据作用机理与降解产物的不同，可将透明质酸酶分为三类，第 一类包括0 -D-乙酰-D-己糖胺酶，将高分子量底物降解成四糖作为主要的终产物。睾丸透 明质酸酶是这一种类的原型，它能够催化转糖基作用，因此，在水解透明质酸的过程中也会 形成六碳糖、二糖以及八碳糖。第二类，以水蛭透明质酸酶为代表的透明质酸酶。第三类， 细菌透明质酸酶，是一种裂解酶。 自1940s以来，动物组织中提取的含透明质酸酶活性的扩散因子已作为促扩散剂 用于临床给药，但是其应用范围一直限定于紧急情况，主要是因为对成分不完全明确的酶 制剂中其他杂质成分的顾虑。动物组织提取透明质酸酶制剂中有效成分小于1%，绝大部分 为异源杂质蛋白。继中性人透明质酸酶基因发现之后，采用DNA来源的重组人源透明质酸 酶（rHuPH20)取代动物源纯化的透明质酸酶，降低了免疫原性，提升了安全性，应用范围也 随之扩大，主要用于皮下输液、眼周手术麻醉、化药和生物药促渗、尿路造影术中造影剂的 吸收。 在许多实体瘤(包括前列腺癌、乳腺癌、胰腺癌、结肠癌以及非小细胞肺癌）细胞表 面都有透明质酸的富集，富含透明质酸的细胞微环境常与肿瘤发展之间存在关联，提供了 恶性肿瘤生长扩散的条件。采用透明质酸酶处理肿瘤生长的组织或器官或处理肿瘤细胞表 面的透明质酸包裹层并联合肿瘤治疗药物，提供了一种抗癌新策略。 但未改造的rHuPH20体内血液中半衰期短于1分钟，无法经血液输入并实现体内 治疗的效果，已有人使用聚乙二醇化学偶联rHuPH20,生产了长效人透明质酸酶，并已用于 人类临床实验治疗肿瘤。 另一方面，透明质酸酶能够降解人工生产的重组大分子量透明质酸，产生出小分 子量透明质酸。小分子量透明质酸，包括含3-10个双糖单位的小分子量透明质酸寡糖 (〇HA)能激活内皮细胞表面CD44并促进内皮细胞增殖，还能与血管内皮生长因子（VEGF)相 协同，促进内皮细胞血管新生，是有生物效应的透明质酸形式。 因此，小分子量透明质酸在化妆品领域应用广泛，因其分子量小，能渗入皮肤真皮 层真皮，具有较强的生物效应。而目前工业生产小分子量透明质酸多采用酸碱降解或者超 声降解。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种体内安全性高、半衰期长的重组长效人透明质酸酶。 为实现上述目的，本专利技术采用如下技术方案：一种重组长效人透明质酸酶，为人透 明质酸酶PH20细胞外部分与人源蛋白的融合蛋白，所述人源蛋白为人白蛋白HSA片段或人 免疫球蛋白IgG2Fc片段；人透明质酸酶PH20细胞外部分与人白蛋白HSA片段的融合蛋白 为PH20-HSA，其氨基酸序列如SEQIDNo. 4所示；人透明质酸酶PH20细胞外部分与人免疫 球蛋白IgG2Fc片段的融合蛋白为PH20-IgFc，其氨基酸序列如SEQIDNo. 5所示。 本专利技术的第二个目的是提供一种上述重组长效人透明质酸酶的编码基因，采用如 下技术方案：其基因序列如SEQIDNo. 6或SEQIDNo. 7所示。 本专利技术的第三个目的是提供一种包含SEQIDNo. 6或SEQIDNo. 7所示基因序列 的表达载体及宿主细胞。 本专利技术的第四个目的是提供上述人透明质酸酶的生产方法，采用如下技术方案： 使用富含GC的动物细胞表达载体pMH3、pMH4或PMH5在中国地仓鼠细胞CH0内表达基因序 列SEQIDNo. 6或SEQIDNo. 7,然后进行分离纯化即得；所述表达载体pMH3、pMH4或pMH5 的基因序列分别如SEQIDNo. 8、9、10所不。 进一步地，所述PH20-HSA使用ProteinA亲和纯化方法进行分离纯化；所述 PH20-IgFc采用离子串联疏水串联蓝胶串联离子方法进行分离纯化。 本专利技术的第五个目的是提供一种稳定储存有上述人透明质酸酶的制剂，采用 如下技术方案：所述制剂包括150-1500IU的PH20-HSA或者PH20-IgFc，10mMNa2HP04， 0? 03%CaC12,0. 1%EDTA-Na2,145mMNaCl，0. 1%HSA，且pH值为 5. 5-7. 5。 本专利技术的第六个目的是提供一种复方制剂，采用如下技术方方案：复方制剂包括 上述的稳定储存有人透明质酸酶的制剂和特定治疗药物。 本专利技术的第七个目的是提供上述重组长效人透明质酸酶在配合给药中的应用，采 用如下技术方方案：将重组长效人透明质酸酶活性在不被降解的情况下传递到人白蛋白或 人免疫球蛋白结合的组织、器官、部位；或将特定治疗药物传递到疾病所在的组织、器官或 部位。 本专利技术的第八个目的是提供上述重组长效透明质酸酶应用，其中的IgFc和HSA片 段提供非功能位点来化学偶联诊断剂、显影剂、药物、治疗用毒素、基因进入疾病组织器官。 本专利技术的第九个目的是提供上述重组长效人透明质酸酶在工业生产小分子透明 质酸中的应用，采用如下技术方案：所述重组长效人透明质酸酶作为工具酶降解大分子透 明质酸产生小分子透明质酸。 由于采用上述技术方案，本专利技术至少具有以下优点： (1)人免疫球蛋白IgG2Fc片段和人白蛋白HSA片段融合人透明质酸酶后，延长了 人透明质酸酶的血液内半衰期，可以经血液或其他方法输送到疾病部位，有效期延长。 (2)人免疫球蛋白IgG2Fc片段和人白蛋白HSA片段可以和人体内特定的受体和结 合蛋白结合，可以将融合的人透明质酸酶携带到这些部位。 (3)与聚乙二醇化学偶联的人透明质酸酶rHuPH20相比，人透明质酸酶人免疫球 蛋白IgG2Fc片段融合蛋白（PH20-IgFc)和人透明质酸酶人白蛋白融合蛋白（PH20-HSA)是 全人源蛋白质，体内使用更安全。 (4)虽然与透明质酸酶rHuPH20相比，人透明质酸酶人白蛋白融合蛋白 (PH20-HSA)和人透明质酸酶人免疫球蛋白IgG2Fc片段融合蛋白（PH20-IgFc)体外活性（t匕 活性）降低，但是他们的体内活性更优越。 (5)本专利技术的PH20-HSA和PH20-IgFc哺乳动物细胞生产后，可采用纯化HSA和 IgFc的特异方法纯化，在生产方法和生产价格方面优于聚乙本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种重组长效人透明质酸酶，其特征在于，为人透明质酸酶PH20细胞外部分与人源蛋白的融合蛋白，所述人源蛋白为人白蛋白HSA片段或人免疫球蛋白IgG2Fc片段；人透明质酸酶PH20细胞外部分与人白蛋白HSA片段的融合蛋白为PH20‑HSA，其氨基酸序列如SEQ ID No.4所示；人透明质酸酶PH20细胞外部分与人免疫球蛋白IgG2Fc片段的融合蛋白为PH20‑IgFc，其氨基酸序列如SEQ ID No.5所示。
【技术特征摘要】
1. 一种重组长效人透明质酸酶，其特征在于，为人透明质酸酶PH20细胞外部分与人源 蛋白的融合蛋白，所述人源蛋白为人白蛋白HSA片段或人免疫球蛋白IgG2Fc片段； 人透明质酸酶PH20细胞外部分与人白蛋白HSA片段的融合蛋白为PH20-HSA，其氨基酸 序列如SEQ ID No. 4所示； 人透明质酸酶PH20细胞外部分与人免疫球蛋白IgG2Fc片段的融合蛋白为PH20-IgFc， 其氨基酸序列如SEQ ID No. 5所示。2. -种权利要求1所述重组长效人透明质酸酶的编码基因，其特征在于，其基因序列 如 SEQ ID No. 6 或 SEQ ID No. 7 所示。3. -种表达载体，其特征在于，含有权利要求2所述的基因。4. 一种宿主细胞，其特征在于，含有权利要求2所述的基因。5. -种权利要求1所述的人透明质酸酶的生产方法，其特征在于，使用富含GC的动物 细胞表达载体pMH3、pMH4或pMH5在中国地仓鼠细胞CH0内表达基因序列SEQ ID No. 6或 SEQ ID No. 7,然后进行分离纯化即得；所述表达载体pMH3、pMH4或pMH5的基因序列分别如 SEQIDNo. 8、9、10 所示。6. 根据权利要求5所述的人透明质酸酶的生产方法，其...
【专利技术属性】
技术研发人员：惠觅宙，刘珊，吴书音，谢波，张欣，
申请(专利权)人：惠觅宙，
类型：发明
国别省市：浙江;33
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