谷子抗逆基因SiRLK35及编码蛋白与应用制造技术

本发明专利技术公开了一种谷子抗逆基因SiRLK35及编码蛋白与应用。本发明专利技术在谷子中分离获得类受体蛋白激酶SiRLK35，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，该基因编码蛋白产物属于丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶。本发明专利技术对该基因在逆境条件下的表达模式进行了研究，同时对该基因进行原核表达载体的构建，验证了该基因可在蛋白水平进行表达，利用斑点法和基因原核表达系统对该基因的功能进行了初步验证，同时检测了该基因在盐处理条件下的生长曲线，通过将该基因异源转化入水稻并获得相应的转基因植株，对其在抗盐及抗逆过程中的作用进行了初步鉴定，对进一步实现对谷子进行有目的，有针对性的品质、性状改良，创新谷子抗逆新种质，具有指导作用。

【技术实现步骤摘要】
谷子抗逆基因SiRLK35及编码蛋白与应用
本专利技术属于基因工程
，具体说，涉及谷子抗逆基因SiRLK35及编码蛋白与应用。
技术介绍
干旱是影响植物正常生长发育的重要限制性因素之一，由于水资源在时间和空间上的分布不均，以及环境变化而引起的世界性的水资源短缺，影响了全球64％的耕地。就我国现状，每年的农业生产缺水为300亿立方米，因干旱造成的粮食损失约为400亿斤/年，水资源短缺使得粮食安全问题受到严重威胁。植物受到干旱胁迫时，最直接的影响就是植物细胞脱水。细胞脱水后，细胞膜细胞壁发生分离，细胞膜原有的结构遭到破坏，膜脂分子结构呈无序放射状排列，膜上出现空隙，膜透性增大，膜蛋白解离，胞质内的可溶性糖、电解质、氨基酸等外流；缺水使气孔关闭，CO2扩散受阻，叶绿体结构改变，光系统II活性受到影响，酶活降低，光合磷酸化解偶联，导致光合作用减弱；水分不足时，分生组织分裂减弱或停止，细胞伸长速度减慢，从而使植物生长受到受抑；植物细胞脱水抑制合成代谢，加强了分解代谢，使细胞正常代谢遭到破坏。导致植物生长停滞甚至死亡。植物在受到干旱胁迫时，细胞感知并将胞外信号传递到胞内，引起胞内第二信使(如Ca2+、活性氧(ROS)、NO、磷酸盐等)的产生，第二信使通过进一步调控相关蛋白激酶的活性，调节下游蛋白的磷酸化状态，最终通过磷酸化作用激活转录因子而调控相应的基因表达。自从1990年首次报道从玉米中克隆到第一个S型植物类受体蛋白激酶(SRLKs)基因Zmpk1之后，在其它物种中也均有发现。目前已知在拟南芥中大约存在40个SRLKs，水稻中有147个。其中甘蓝中的SRK、SFR2；拟南芥中的ARK1、ARK2、ARK3、RLK1和PR5K，水稻中的OsPK10及烟草中的NTS16及BcRK，均属于SRLKs。目前，对于SRLKs功能研究的报道并不多，这类蛋白主要在植物种胚形态发生、发育及自交不亲和等方面具有重要的生物学功能。含有S-结构域的RLKs(SRLKs)作为RLKs家族中第二大类，广泛存在于单子叶及双子叶植物中。近年来，随着对RLKs研究的深入，对SRLKs生物学功能的研究也越来越受到人们的关注。Kim等(2009)研究发现，CBRLK1(calmodulin-bindingreceptor-likeproteinkinase)编码一个S-型的类受体蛋白激酶，能够通过调控PR1基因的表达负调拟南芥的抗病反应。进一步研究发现，CBRLK1能与钙调素互作，而钙调素(Calmodulin,CaM)通过与胞内重要第二信使Ca2+直接作用，在植物细胞感知外界刺激进行原初响应及信号向下游的转导过程中具有重要作用。水稻中OsSIK2编码一个SRLK蛋白，其表达能明显的被ABA、PEG、NaCl和4℃所诱导；过表达OsSIK2可增强转基因水稻对干旱和盐胁迫的抗性，而且过表达株系表现出叶片提前发育和延迟衰老的表型。最近在大豆中研究发现，GsSRK编码一个SRLK，其表达能够明显的被ABA、干旱和盐胁迫所诱导，在拟南芥中过表达GsSRK能明显增强转基因株系在盐胁迫下种子的萌发、主根的伸长及莲座叶的生长等。这些结果表明SRLKs可参与非生物胁迫响应，并可能通过对胁迫信号进行整合从而对植株的发育进行调控，使植株更好的适应不利的环境。谷子(SetariaitalicaL.Beauv.)又称为粟，是我国传统优势作物及粮饲兼用作物，在我国北方地区种植广泛，其种植面积占世界的80％。但由于基因组测序工作的滞后，长期以来谷子未受到国际科学界的关注。进入21世纪以来，谷子因其抗旱耐瘠、高光效、耐储藏、基因组小以及生育期短等突出优势迅速发展成为功能基因组研究新的候选模式作物。近年来其营养保健价值、国际竞争力和产量潜力被重新认识。因此，对谷子进行抗逆研究也越来越有必要，可以为对谷子进行有目的、有针对性的品质、性状研究及抗旱机制的解析提供理论依据。
技术实现思路
本专利技术的目的在于克服现有技术的不足，提供了一种新的谷子抗逆基因SiRLK35。本专利技术以自然干旱处理的“豫谷1号”为材料，通过iTRAQ技术筛选到一表达量发生明显变化的S型类受体蛋白激酶基因，命名为SiRLK35。通过构建SiRLK35基因的植物双元表达载体，利用基因工程手段获得了该基因的转基因植物材料，对该基因的生物学功能及其在植物抗旱抗逆等方面的应用进行了研究。通过构建该基因的原核表达载体，检测蛋白水平的表达情况，分析其在原核菌株中的功能，初步验证了该基因的抗逆能力。通过对获得的转基因水稻植株进行干旱胁迫处理，初步验证转基因植株的抗逆能力，揭示该基因在植物抗逆过程中的作用。因此，本专利技术还有一个目的是在于提供了一种谷子抗逆基因SiRLK35在植物抗逆(抗旱和耐盐)育种中的应用，提高了植物对逆境(干旱和水渍)的耐受能力，保证了作物的产量和品质免受或少受逆境胁迫的不利影响。为此，本专利技术采用的技术方案是：谷子抗逆基因SiRLK35，克隆该基因的方法是，首先提取谷子叶片的RNA，反转录得到单链cDNA，以单链cDNA为模板，以SEQIDNo.3和SEQIDNo.4序列所示的特异引物，通过PCR获得SiRLK35基因的全长序列。引物序列如下：SiRLK35S11:5’-ACGGTTTATTTGCTTGGA-3’(SEQIDNo.3)SiRLK35A1:5’-TCATAAATTTGACTTCATTTCA-3’(SEQIDNo.4)所述谷子抗逆基因SiRLK35，其核苷酸序列如SEQIDNo.1所示，氨基酸序列如SEQIDNo.2所示，该基因编码产物属于S型类受体蛋白激酶。本专利技术谷子抗逆基因SiRLK35的生物信息学分析显示，该蛋白属于S型类受体蛋白激酶(SRLKs)家族，基因序列分析显示，SiRLK35包含1989个碱基，含有相对保守的蛋白激酶区，但进化分析显示，其与拟南芥、水稻、玉米、大麦等植物中的SRLKs同源性较低，为7％-23％，与我们之前在水稻中分离到的种胚特异基因OsESG1的序列同源性也仅为9％。这种序列上的差异性，结合对其表达模式的初步分析，暗示SiRLK35在与SRLKs家族成员功能上具有一定的共性，但同时也具有特异的、独特的功能，并可能在谷子抗旱的过程具有重要作用。为进一步研究SiRLK35基因的功能，本专利技术使用RT-PCR对该基因的表达模式进行研究，结果表明，SiRLK35可以被干旱、盐胁迫、植物激素GA、ABA、MeJA等诱导表达，暗示该基因在植物抗逆和体内信号转导方面发挥一定的作用。本专利技术还根据谷子SiRLK35基因序列设计特异引物，通过PCR方法扩增得到目的基因，酶切后，将目的基因SiRLK35与PET28a载体连接，获得重组质粒pET28a-SiRLK35，以此质粒转化大肠杆菌菌株BL21(DE3)，原核表达载体构建完成，IPTG诱导表达融合蛋白，SDS-PAGE电泳分析，获得预期大小的蛋白条带，证明该基因在蛋白水平完成了表达，并同时对其原核表达系统进行了优化。本专利技术同时利用斑点法对SiRLK35基因功能进行验证，将成功转入pET28a质粒和pET28a-SiRLK35重组质粒的大肠杆菌BL21(DE3)经IPTG诱导后，在含有不同浓度NaCl的LB平板培养基上点样，3本文档来自技高网...

【技术保护点】
谷子抗逆基因SiRLK35，其核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。

【技术特征摘要】
1.谷子抗逆基因SiRLK35，其核苷酸序列如SEQIDNo.1所示。2.一种权利要求1所述的谷子抗逆基因SiRLK35编码的蛋白质，其序列为SEQIDNO.2所示。3.权利要求1所述的谷子抗逆基因SiRLK35在提高作物的抗旱方面的应用。4.权利要求1所述的谷子抗逆基因SiRLK35在提高作物的耐盐方面的应用。5.克隆权利要求1所述的谷子抗逆基因SiRLK35的方法，其特征是，提取谷子RNA，反转录获得单链cDNA，以单链cDNA为模板，用序列如SEQIDNO.3和SEQIDNO.4所示特异引物，通过PCR获得基因SiRLK35的全长序列。6.一种含有权利要求1所述的谷子抗逆基因S...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘炜，王一帆，潘教文，王庆国，李臻，
申请(专利权)人：山东省农业科学院生物技术研究中心，
类型：发明
国别省市：山东,37