葡萄糖氧化酶基因GOD、利用其编码的蛋白、转化的巴斯德毕赤酵母及其制备制造技术

本发明专利技术属于新基因的制备，特别是指一种葡萄糖氧化酶基因GOD、利用其编码的蛋白以及转化的巴斯德毕赤酵母Pichia pastoris。葡萄糖氧化酶基因GOD是以5′端ATGAAGTCCACTATTATCACCTCCA和3′端CTAGGCACTTTTGGCATAGTCTTCA为特异引物，以点青霉DNA为模板，采用PCR扩增方法获得。本发明专利技术解决了目前重组葡萄糖氧化酶基因进行异源表达的问题，利用本发明专利技术获得了全长的GOD基因及其构建的穿梭表达载体，进一步转化到巴斯德毕赤酵母Pichia pastoris，经筛选鉴定得到一株较原始菌株较高分泌表达葡萄糖氧化酶的菌株。本发明专利技术为进一步的工厂化生产大大节约了成本费用，提高了葡萄糖氧化酶的经济效益。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于新基因的制备，特别是指一种葡萄糖氧化酶基因GOD、利用其编码的蛋白以及转化的巴斯德毕赤酵母Pichiapastoris。
技术介绍
葡萄糖氧化酶(EC1.1.3.4)是一种能够专一的催化β-D-葡萄糖氧化为δ-D-葡萄糖酸，并且利用分子氧作为受体产生过氧化氢的需氧脱氢酶。葡萄糖氧化酶是国家允许使用的酶制剂之一，对人体无毒、无副用作，具有去除葡萄糖、脱氢、杀菌等功效，已被广泛应用于食品、纺织、化工、饲料、医药等行业中。葡萄糖氧化酶广泛分布于动植物及微生物体内，目前用于研究及生产葡萄糖氧化酶的主要菌株为黑曲霉(Abperrillusniger)和点青霉(Penicilliumnotatum)，这是因为霉菌产酶能力强，易于规模化生成；但黑曲霉和青霉菌发酵生产GOD过程中，过氧化氢酶、纤维素酶及淀粉酶等大量杂酶的存在给纯化带来相当的困难。近几年市场对葡萄糖氧化酶的需求量逐年增长。但我国葡萄糖氧化酶技术水平尚处于研究发展的初级阶段，存在产量低、酶活低、提纯繁琐、酶活检测方法操作复杂等问题，使国内葡萄糖氧化酶仍以进口为主。并且传统以优化发酵条件提高葡萄糖氧化产量和酶活的方法，存在着精确度低、实验次数多、周期长、不能快速有效地提高葡萄糖氧化酶的产量和酶活的技术缺陷。重组葡萄糖氧化酶基因进行异源表达可有效地解决这些问题，尤其是毕赤酵母表达外源蛋白具有表达量高、稳定性好、培养成本低和产物易分离纯化等优点，适于大体积高密度连续发酵，具有强且易控的醇氧化酶(Alcoholoxidase，AOX)启动子等优点，可严格控制外源基因的表达。通过基因工程手段改造葡萄糖氧化酶生产菌株，获得萄糖氧化酶准确高效的生产和提取方法，提高产酶量，为后期的工业化生产提供了导向基础，提高其经济效益。
技术实现思路
本专利技术的目的之一在于提供一种葡萄糖氧化酶基因GOD。本专利技术的目的之二在于提供一种葡萄糖氧化酶基因GOD的制备方法。本专利技术的目的之三在于提供一种利用葡萄糖氧化酶基因GOD编码的蛋白。本专利技术的目的之四在于提供一种利用葡萄糖氧化酶基因GOD转化巴斯德毕赤酵母Pichiapastoris的方法。本专利技术的整体技术构思是：葡萄糖氧化酶基因GOD，其基因序列为SEQIDNo.1。葡萄糖氧化酶基因GOD的制备方法，是以5′端ATGAAGTCCACTATTATCACCTCCA和3′端CTAGGCACTTTTGGCATAGTCTTCA为特异引物，以点青霉DNA为模板，采用PCR扩增方法获得。利用萄萄糖氧化酶基因GOD编码的蛋白，其序列为SEQIDNo.2。利用葡萄糖氧化酶基因GOD转化的巴斯德毕赤酵母Pichiapastoris，其保藏编号为CGMCCNo.11626。本专利技术中的巴斯德毕赤酵母Pichiapastoris申请人已于2015年11月6日提交中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏编号为CGMCCNo.11626，该保藏机构的地址位于北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，该保藏机构的简称为CGMCC。利用葡萄糖氧化酶基因GOD转化的巴斯德毕赤酵母Pichiapastoris的制备方法，其制备方法中的步骤如下：A、通过PCR方法设计引物将点青霉的葡萄糖氧化酶基因序列中的信号肽编码序列去除，引物序列如下：GodF:5′GGCTGAAGCTTACGTAGAATTCTATAGCCCGGCCGAGCAGATCGAC3′，序列中下划线部分为上游引物添加限制性内切酶EcoRI识别位点；GodR:5′GAGATGAGTTTTTGTTCTAGAGCGGCCGCCTAAGCTTTCTTGGCATAGTCTTC3′，序列中下划线部分为下游添加限制性内切酶NotI识别位点；B、PCR产物经纯化回收采GIBSON连接到表达载体pMD-AOX的EcoRI和NotI位点上，转化到E.coliDH5α，酶切验证筛选阳性克隆，并送测序；C、测序正确重组质粒pMD-AOX-GOD经PmeI酶切后线性化。用2μg线性化pMD-AOX-GOD质粒电击转化80μl毕赤酵母PichiapastorisX33感受态细胞，然后将转化细胞涂于含100μg/mlG418的YPD平板上，30℃培养96h；随机挑选阳性菌落转接含100μg/mLG418的液体YPCS培养基，在温度30℃、转速200r/min条件下振荡培养3d，期间每隔24h加1％的甲醇,测定发酵液上清中的葡萄糖氧化酶活性。本专利技术的具体
技术实现思路
还有：所述的葡萄糖氧化酶基因GOD的制备方法中是利用所设计的特异性引物，以点青霉DNA为模板，在扩增仪上按照98℃预变性5分钟；30个PCR循环：98℃变性30秒，65℃退火30秒，72℃延伸1分钟；72℃延伸10分钟的程序进行PCR扩增；PCR反应均按如下成份及用量进行:反应体系为50μl:基因组DNA100ng，引物各0.2μmol/L，dNTPs250μmol/L,5×Q5High-FidelityDNAPolymeraseBuffer10μl,Q5High-FidelityDNAPolymerase0.5μl。PCR产物跑1％的琼脂糖电泳观察结果；PCR产物通过T4DNA连接酶连接到质粒pMD18-T载体上，并转化大肠杆菌DH5α，然后涂布到具有氨苄青霉素的LB平板上，37℃过夜培养直至菌落长出，随机挑取2个克隆进行测序，序列分析获得GOD基因序列。本专利技术所取得的实质性特点和显著的技术进步在于：1、本专利技术通过PCR技术获得了一个全长的GOD基因序列，该基因全长为1815bp，GC含量为55.4％。同源分析该基因与以往的报道的GOD的基因序列具有一定的差异，证明该基因是一个新的GOD基因。2、本专利技术中所制备的巴斯德毕赤酵母PichiapastorisCGMCCNo.11626突破了传统黑曲霉和青霉菌发酵生产GOD过程中，夹杂大量过氧化氢酶、纤维素酶及淀粉酶等杂酶，难纯化的问题。利用本专利技术所获得的转基因毕赤酵母工程菌，在10L发酵罐水平检测条件下，甲醇诱导144小时，发酵液中的酶活达到594U/ml，显著提高了发酵酶活；并且通过基因工程手段改造葡萄糖氧化酶生产菌株，还可以获得萄糖氧化酶准确高效的生产，提高产酶量(9g/L)，为后期的工业化生产提供了导向基础，提高经济效益。本专利技术中的巴斯德毕赤酵母Pichiapastoris申请人已提交中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏编号为CGMCCNo.11626，该保藏机构的地址位于北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，该保藏机构的简称为CGMCC。附图说明本专利技术的附图有：图1是本专利技术中葡萄糖氧化酶基因GOD及利用其编码的蛋白的序列表。图2点青霉GOD基因全长结果。以点青霉基因组DNA为模板，引物P1和P2进行PCR扩增，扩增出现一条约1800bp的特异带，。序列分析结果表明，其基因组DNA长1815bp，本文档来自技高网...

【技术保护点】
葡萄糖氧化酶基因GOD，其特征在于其基因序列为SEQ ID No.1。

【技术特征摘要】
1.葡萄糖氧化酶基因GOD，其特征在于其基因序列为SEQIDNo.1。
2.萄萄糖氧化酶基因GOD的制备方法，其特征在于是以5′端ATGAAGTCCACTATTATCACCTCCA和3′端CTAGGCACTTTTGGCATAGTCTTCA为特异引物，以点青霉DNA为模板，采用PCR扩增方法获得。
3.利用萄萄糖氧化酶基因GOD编码的蛋白，其特征在于其序列为SEQIDNo.2。
4.利用葡萄糖氧化酶基因GOD转化的巴斯德毕赤酵母Pichiapastoris，其特征在于其保藏编号为CGMCCNo.11626。
5.根据权利要求4所述的巴斯德毕赤酵母Pichiapastoris的制备方法，其特征在于其制备方法中的步骤如下：
A、通过PCR方法设计引物将点青霉的葡萄糖氧化酶基因序列中的信号肽编码序列去除，引物序列如下：GodF:5′GGCTGAAGCTTACGTAGAATTCTA...

【专利技术属性】
技术研发人员：高庆华，胡美荣，吴芳彤，陶勇，秦艳梅，马清河，王云鹏，
申请(专利权)人：河北省微生物研究所，中国科学院微生物研究所，
类型：发明
国别省市：河北;13