本发明专利技术公开了抗毒素SO_1445或其编码基因在提高质粒在宿主细胞中的稳定性中的应用。所述的抗毒素SO_1445，其氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示，编码所述的抗毒素SO_1445的抗毒素基因SO_1445，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。本发明专利技术从希瓦氏菌MR‑1中克隆得到抗毒素基因SO_1445，发现引入抗毒素基因SO_1445的重组质粒的稳定性相较空质粒显著增加。本发明专利技术不仅有望减少抗生素在生产以及科学研究中的使用，同时为稳定质粒在细菌宿主中的存在提供了新的方法与策略。
【技术实现步骤摘要】
抗毒素SO_1445或其编码基因在提高质粒在宿主细胞中的稳定性中的应用
：本专利技术属于生物工程
，具体涉及抗毒素SO_1445或其编码基因在提高质粒在宿主细胞中稳定性中的应用。
技术介绍
：质粒广泛存在于许多细菌以及酵母菌等生物中，是细胞染色体外能够自主复制的很小的环状DNA分子。质粒是分子操作的基础，经过改造质粒作为载体广泛的被应用在原核生物及真核生物的基因操作中。目前用于生产各种抗生素，蛋白以及生活中常用的酶等的工程菌的构建主要有两种方法：第一种方法是将编码基因或基因簇整合到基因组上，这样外源基因编码的产物就可以在细胞内持续且稳定的表达。这种方法的缺点是表达量相对低，导致目的产物的获得量低；第二种方法是通过将表达目的产物的基因或者基因簇克隆到中高拷贝的表达质粒上，通过添加诱导剂或利用组成型启动子来大量表达目的产物。该种方法的缺点是质粒表达载体一般都不稳定，通常需要添加抗生素来维持。抗生素的添加不仅会增加生产成本，更重要的是会对环境造成污染，同时加重抗生素的扩散问题。不仅在生产中，在科学研究中，如何来维持质粒在不同宿主中的稳定性已成为限制质粒使用的重要因素。为了能够克隆大片段DNA或增加质粒的转化效率，目前生产以及研究中常用的质粒通常较小，在胞内拷贝数较高。这些载体质粒不具有独立的复制，且在宿主细胞中的稳定性很差，克隆载体在细菌或者细胞中的维持主要通过添加抗生素来实现。目前质粒的拷贝数多少一般与质粒的稳定性呈反比，通过降低质粒的拷贝数来增加质粒的稳定性。对于如何增加中高拷贝质粒的稳定性目前还很少有研究报道，而通过在质粒上引入单独的抗毒素来增加质粒的稳定性方面的研究还没有报道。
技术实现思路
：本专利技术的目的是克服现有技术中的缺陷，提供抗毒素SO_1445或其编码基因在提高质粒在宿主细胞中的稳定性中的应用。本专利技术的第一个目的是提供抗毒素SO_1445在提高质粒在宿主细胞中的稳定性中的应用，所述的抗毒素SO_1445的氨基酸序列如SEQIDNO.3所示。本专利技术的第二个目的是提供编码所述的抗毒素SO_1445的抗毒素基因SO_1445在提高质粒在宿主细胞中的稳定性中的应用。优选，所述的抗毒素基因SO_1445的核苷酸序列如SEQIDNO.2所示。本专利技术的第三个目的是提供一种含有抗毒素基因SO_1445或如SEQIDNO.1所示的核苷酸序列的重组质粒，所述的抗毒素基因SO_1445的核苷酸序列如SEQIDNO.2所示。所述的质粒优选为pCA24N、pUC19或pACYC184。本专利技术的第四个目的是提供一种宿主细胞，其特征在于，所述的宿主细胞含有上述的重组质粒。所述的宿主细胞优选为大肠杆菌BW25113。本专利技术的第五个目的是提供一种提高质粒在宿主细胞中的稳定性的方法，其特征在于，将抗毒素基因SO_1445或如SEQIDNO.1所示的核苷酸序列连接到质粒上构建成重组质粒，然后将重组质粒转化到宿主细胞中，所述的抗毒素基因SO_1445的核苷酸序列如SEQIDNO.2所示。所述的质粒优选为pCA24N、pUC19或pACYC184。本专利技术从希瓦氏菌MR-1中克隆得到抗毒素基因SO_1445，将抗毒素基因SO_1445连接到质粒上，在不添加抗生素的条件下，在不同天数时检测引入抗毒素基因SO_1445的重组质粒与空质粒在宿主中的稳定性，发现引入抗毒素基因SO_1445的重组质粒的稳定性相较空质粒显著增加。本专利技术不仅有望减少抗生素在生产以及科学研究中的使用，同时为稳定质粒在细菌宿主中的存在提供了新的方法与策略。具体实施方式：以下实施例是对本专利技术的进一步说明，仅用于例证，而不是对本专利技术保护范围的限制。实施例1：在常用质粒pCA24N，pUC19，pACYC184上克隆抗毒素基因SO_1445(1)在常用质粒pCA24N上克隆抗毒素基因SO_1445pCA24N质粒为模式菌大肠杆菌中的中等拷贝数表达载体，常用于特定蛋白在胞内的表达纯化等。利用Tiangen试剂盒提取野生型希瓦氏菌MR-1基因组DNA作为后续PCR克隆的模板；设计PCR扩增抗毒素基因SO_1445(其核苷酸序列如SEQIDNO.2所示)的引物，引物序列如下：上游引物SO_1445-F(pCA24N)：5’-GCCAGCACAATCAAACCCGTGTC-3’；下游引物SO_1445-R(pCA24N)：5’-CCTTTGTGGCATGTAGGGGCTGCC-3’。以SO_1445-F(pCA24N)和SO_1445-R(pCA24N)为引物，野生型希瓦氏菌MR-1基因组DNA为模板，PCR扩增抗毒素基因SO_1445的编码区，PCR扩增条件为：先95℃5min；然后95℃30s，56℃30s，72℃30s，共30个循环；最后72℃10min。反应结束后，将PCR扩增产物进行1.0％琼脂糖凝胶电泳，回收并纯化约300bp的目的基因片段。再将其与经sacI单酶切，去磷酸化处理的载体pCA24N用T4DNA连接酶(TaKaRa公司)进行连接，将连接产物转入大肠杆菌BW25113感受态细胞，筛选阳性转化子，PCR验证并送测序公司测序获得重组质粒pCA24N-SO_1445以及含有该重组质粒的目的菌株。(2)在常用质粒pUC19上克隆抗毒素基因SO_1445pUC19质粒为常用的高拷贝质粒，不含有可供目的基因使用的诱导型启动子，在进行克隆时将抗毒素基因SO_1445以及SO_1445上游的启动子区域(上游290bp，如SEQIDNO.1的第1～第290位碱基所示)一同克隆到pUC19中(即将SEQIDNO.1所示的序列克隆到载体pUC19中)，pUC19采用商业化的pMD19-T(TaKaRa公司)替代。设计PCR扩增抗毒素基因SO_1445以及上游启动子区域的引物，引物序列如下：上游引物SO_1445-F(pUC19)：5’-AAGGTCATAATGCTTCTGCGACG-3’与下游引物SO_1445-R(pUC19)：5’-CTATTTGTGGCATGTAGGGGCT-3’。以野生型希瓦氏MR-1基因组DNA为模板，以SO_1445-F(pUC19)和SO_1445-R(pUC19)为引物，PCR扩增抗毒素基因SO_1445以及上游启动子区，PCR扩增条件为：先95℃5min；然后95℃30s，56℃30s，72℃1min，共30个循环；最后72℃10min。反应结束后，将PCR扩增产物进行1.0％琼脂糖凝胶电泳，回收并纯化约600bp的目的基因片段，将其克隆入载体pMD19-T(TaKaRa公司)中，将重组质粒转化大肠杆菌BW25113感受态细胞，筛选阳性转化子，PCR验证并送测序公司测序获得重组质粒pUC19-PSO_1445-SO_1445以及含有该重组质粒的目的菌株。(3)在常用质粒pACYC184上克隆抗毒素基因SO_1445pACYC184质粒的复制起始区来源于p15A质粒，它的特点是可以与ColE1类型的质粒(pUC19，pBR322等)在细胞内兼容。pACYC184质粒不含有可供目的基因使用的诱导型启动子，因此在进行克隆时将抗毒素基因SO_1445以及SO_1445上游的启动子区域(上游290bp，如SEQIDNO.1的第1～第290位碱本文档来自技高网...
【技术保护点】
抗毒素SO_1445在提高质粒在宿主细胞中的稳定性中的应用，所述的抗毒素SO_1445的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。
【技术特征摘要】
1.抗毒素SO_1445在提高质粒在宿主细胞中的稳定性中的应用，所述的抗毒素SO_1445的氨基酸序列如SEQIDNO.3所示。2.编码权利要求1所述的抗毒素SO_1445的抗毒素基因SO_1445在提高质粒在宿主细胞中的稳定性中的应用。3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述的抗毒素基因SO_1445的核苷酸序列如SEQIDNO.2所示。4.一种含有抗毒素基因SO_1445或如SEQIDNO.1所示的核苷酸序列的重组质粒，所述的抗毒素基因SO_1445的核苷酸序列如SEQIDNO.2所示。5.根据权利要求4所述的重组质粒，其特征在于，所述的...
【专利技术属性】
技术研发人员：王晓雪，姚建云，李百元，
申请(专利权)人：中国科学院南海海洋研究所，
类型：发明
国别省市：广东,44
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