本发明专利技术公开了一种SUMO和SUMO蛋白酶基因及其编码蛋白和应用。本发明专利技术的一种酿酒酵母基因sumo(S)，其由序列表SEQ ID No.1的核苷酸序列定义。本发明专利技术的一种酿酒酵母基因sumo(S)的编码蛋白，其由序列表SEQ ID No.2的氨基酸序列定义。本发明专利技术的一种SUMO蛋白酶基因ulp(S)，其由序列表SEQ ID No.3的核苷酸序列定义。本发明专利技术的一种SUMO蛋白酶基因ulp(S)的编码蛋白，其由序列表SEQ ID No.4的氨基酸序列定义。本发明专利技术能够实现酿酒酵母sumo基因和SUMO蛋白酶ulp基因在大肠杆菌中的高表达，具体的说是实现在大肠杆菌常用的表达菌株BL21(DE3)中实现高表达，并保证功能不受影响。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及基因工程和蛋白质工程领域，具体涉及SUMO和SUMO蛋白酶基因及其编码蛋白和应用。
技术介绍
大肠杆菌表达系统常被用来表达重组蛋白，但也存在一些缺陷，当过表达一些外源蛋白时常会形成不溶性无功能的包涵体沉淀[VillaverdeA,CarrioM,M.2003.Proteinaggregationinrecombinantbacteria:biologicalroleofinclusionbodies.Biotechnolletters.25(17):1385-1395]，融合标签表达已被证明可以用来改善外源重组蛋白的产量和折叠[EspositoD,ChatterjeeD,K.2006.Enhancementofsolubleproteinexpressionthroughtheuseoffusiontags.Curr.Opin.inBiotechnol.17(4):353-358]。传统的融合标签有麦芽糖结合蛋白MBP，谷胱甘肽S-转移酶GST，硫氧还蛋白Trx等，这些标签融合体系要求在标签和目的蛋白间加上一段可被某些蛋白酶识别的酶切序列，以便后来研究中除去标签。常用的蛋白酶有烟草蚀斑病毒蛋白酶TEVp，凝血酶，Xa因子等，这些蛋白酶酶切后会在酶切位点下游也就是目的蛋白N端留下若干氨基酸，残留的氨基酸可能会影响目的蛋白的生物学活性或者结晶，对于药用蛋白可能会产生新的免疫原活性[TerpeK.2003.Overviewoftagproteinfusions:frommolecularandbiochemicalfundamentalstocommercialsystems.Applmicrobiolandbiotechnol.60(5):523-533]。小泛素相关修饰蛋白SUMO与传统的标签蛋白不同，SUMO来源于真核生物，在大肠杆菌中并不存在，也没有对应的SUMO蛋白酶[JeffreyG,Metal.2005.ComparisonofSUMOfusiontechnologywithtraditionalgenefusionsystems:EnhancedexpressionandsolubilitywithSUMO.ProteinScience.15:182–189.]。在酵母中只含有一种SUMO基因(SMT3)，并存在严格空间构象专一性的SUMO蛋白酶Ulp1，因为是构象专一性蛋白酶，所以在SUMO标签C端可直接融合目的蛋白而无需添加酶切序列，酶切后目的蛋白N端不会有残留氨基酸[Kawabe,Y.,2000.CovalentmodificationoftheWerner’ssyndromegeneproductwiththeubiquitin-relatedprotein,SUMO-1.J.Biol.Chem.275:20963–20966.]。鉴于SUMO标签优良的改善折叠和促进表达特性，加之Ulp1酶切特异性和活力均很高，所以近年来SUMO融合表达系统越来越受到人们的重视。酵母含有两种SUMO蛋白酶：Ulp1和Ulp2，两种酶共有一段约200氨基酸的催化结构域称为ULP即Ulp1(403～621)p，ULP显示了完整的蛋白酶活性[Mossessova,E.andLima,C.D.2000.Ulp1-SUMOcrystalstructureandgeneticanalysisrevealconservedinteractionsandaregulatoryelementessentialforcellgrowthinyeast.Mol.Cell.5:865–876.]。重组表达的SUMO蛋白酶就是Ulp1的C端结构域。但因为大肠杆菌的密码子偏爱性，导致来源于酵母的SUMO和ULP在大肠杆菌中表达量比较低。已有研究表明提高宿主某些稀有tRNA丰度可以提高某些目的蛋白的表达量[Kane,J.F.1995.Effectsofrarecodonclustersonhigh-levelexpressionofheterologousproteinsinEscherichiacoli.Curr.Opin.inBiotechnol.6,494–500]，也有公司提供编码某些稀有tRNA基因的商品化大肠杆菌菌株。然而提高宿主菌的稀有tRNA丰度并非提高目的蛋白表达量的有效途径，首先，tRNA存在表达后修饰，有研究表明过表达某些稀有tRNA会出现仅部分tRNA发生修饰，导致翻译保真性的降低[Wilson,R.K.andRoe,B.A.1989.PresenceofthehypermodifiednucleotideN6-(delta2-isopentenyl)-2-methylthioadenosinepreventscodonmisreadingbyEscherichiacoliphenylalanyl-transferRNA.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.86,409–413]。其次，有研究表明稀有tRNA的过表达会加重宿主菌的代谢负担，菌株生长缓慢[Wahab,S.Z.etal.1993.EffectsoftRNA(1Leu)overproductioninEscherichiacoli.Mol.Microbiol.7,253–263]。一般来说，基因中含有宿主很少使用的密码子越多，目的蛋白的表达量越低，而在基因5’端存在稀有密码子，则情况尤甚[GustafssonC,etal.2004.Codonbiasandheterologousproteinexpression.TRENDSinBiotechnology.22,(7):346-353]。为了解决这种情况，早在八十年代就有科学家通过人工合成基因的方式更改外源基因的稀有密码子，实现蛋白的高水平表达[Nambiar,K.P.etal.1984.TotalsynthesisandcloningofagenecodingfortheribonucleaseSprotein.Science.223,1299–1301]，但鉴于合成基因的费用较高，此方法主要用于较短的基因，九十年代开始更多使用定点突变的方法进行密码子的优化[KinkJ.A.etal.1991.EfficientexpressionoftheParameciumcalmodulingeneinEscherichiacoliafterfourTAA-to-CAAchangesthroughaseriesofpolymerasechainreactions.J.Protozool.38,441–447]，在已报道的密码子优化案例中与野生型相比，优化的基因绝大多数都实现了蛋白表达量的显著提升[GustafssonC,etal.2004.Codonbiasandheterologousproteinexpression.TRENDSinBiotechnology.22,(7):346–353]。目前，缺乏一种在大肠杆菌中的表达量高的SUMO和SUMO蛋白酶基因及其编码蛋白的应用。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是提供了一种在大肠杆菌中表达量高的SUMO与S本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种酿酒酵母基因sumo(S)，其特征在于：其由序列表SEQ ID No.1的核苷酸序列定义。
【技术特征摘要】
1.一种酿酒酵母基因sumo(S)，其特征在于：其由序列表SEQIDNo.1的核苷酸序列定义。2.一种酿酒酵母基因sumo(S)的编码蛋白，其特征在于：其由序列表SEQIDNo.2的氨基酸序列定义。3.一种SUMO蛋白酶基因ulp(S)，其特征在于：其由序列表SEQIDNo.3的核苷酸序列定义。4.一种SUMO蛋白酶基因ulp(S)的编码蛋白，其特征在于：其由序列表SEQIDNo.4的氨基酸序列定义。5.权利要求1所述的酿酒酵母基因sumo(S)的表达载体，权利要求3所述的SUMO蛋白酶基因ulp(S)的重组载体。6.一种pET28b-sumo(S)和pMF-ulp(S)的重组载体的制备方法，其特征在于包括如下步骤：(1)分别人工合成序列表SEQIDNO：1和SEQIDNO：3所示的基因；(2)分别构建pET28b-sumo(S)和pMF-ulp(S)的重组载体；(3)用步骤(2)所述重组表达质粒分别转化宿主菌构建对应的基因工程菌；(4)利用步骤(3)所述基因工程菌分别表达pET28b-sumo(S)和pMF-ulp(S)的重组载体；(5)利用纯化技术，分别获取pET28b-sumo(S)和pMF-ulp(S)的重组载体。7.根据权利要求6所述的pET28b-sumo(S)和pMF-ulp(S)的重组载体的制备方法，其特征在于：在步骤(2)中，所述酿酒酵母基因sumo(S)的表达载体为pET28b，所述SUMO蛋白酶基因ulp(S)的表达载体为pMF载体，宿主菌为大肠杆菌DH5α；在步骤(2)中，采用DNA重组技术，将序列表SEQIDNO：1所示的sumo(S)基因和pET28b载体用NdeⅠ和BamHⅠ酶切，将序列表SEQIDNO：3所示的ulp(S)基因和pMF载体用BamHⅠ，HindⅢ酶...
【专利技术属性】
技术研发人员：范军，周旋，
申请(专利权)人：安徽农业大学，
类型：发明
国别省市：安徽;34
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