一种酯酶PHE14及其编码基因和应用制造技术

本发明专利技术公开了一种酯酶PHE14及其编码基因和应用。本发明专利技术从海洋假单胞菌(Pseudomonadaceae oryzihabitans)HUP022中开发得到新的酯酶基因PHE14，全长为645bp，其编码的酯酶PHE14含有214个氨基酸。通过克隆酯酶基因PHE14并将其连接表达载体pET‑28a(+)后转化大肠杆菌BL21(DE3)，培养并诱导表达后，得到了重组表达的酯酶PHE14。酯酶PHE14可用于制备手性乳酸甲酯，利用重组表达的酯酶PHE14作为催化剂，制备得到了光学纯度大于99％的(S)‑乳酸甲酯。酯酶PHE14在生物化工和生物医药等领域具有非常大的应用价值。

Esterase PHE14, coding gene and application thereof

The present invention discloses esterase PHE14 and its coding gene and application. The present invention from marine Pseudomonas (Pseudomonadaceae oryzihabitans) esterase gene PHE14 new development HUP022, length of 645bp, esterase PHE14 encoding 214 amino acids. By cloning the esterase gene PHE14 and the link of the expression vector pET 28a (+) and then transformed into E.coli BL21 (DE3), cultured and induced by recombinant expression of esterase PHE14. Esterase PHE14 can be used for the preparation of chiral methyl lactate, esterase PHE14 using recombinant expression as catalyst, preparation of the optical purity higher than 99% (S) methyl lactate. Esterase PHE14 has great application value in the fields of Biochemistry and biomedicine.

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于生物化工和生物
，具体涉及一种酯酶PHE14及其编码基因和应用。
技术介绍
手性药物不同对映体往往会表现出截然不同的生理活性和毒性，如R型的“反应停”是孕妇用镇痛药和止痛药，而S型的“反应停”对胎儿则有致畸作用；巴比妥酸盐S-(-)异构体具有抑制神经活动的作用，而R-(+)异构体却具有兴奋作用。所以在制药行业手性化合物的合成具有非常重要的意义。为了减少有毒副作用的对映体，并降低其生物活性，光学纯手性药物的合成研究一直是制药研究领域的焦点。此外，由于化工行业对于手性化学品需求量巨大，手性化合物的合成在化学工业也至关重要。乳酸酯，特别是乳酸甲酯，是重要的香料及工业溶剂，在食品、医药、农业、精细化工等领域都得到广泛的应用。(S)-乳酸甲酯是合成一种重要的非甾体镇痛药布洛芬的药物中间体，并且由(S)-乳酸甲酯合成的(S)-布洛芬的疗效要比(R)-布洛芬高28倍。但由于生产技术和生产成本方面的原因，目前我国市售的布洛芬大多数是外消旋体。随着人们对手性药物不同对映体的生理和药理性差异的了解，以及认识到合成和使用单一对映体药物的重要性，由光学纯乳酸甲酯直接合成相应光学纯药物的研究将会受到越来越多的重视。手性化合物的合成主要有化学法、色谱拆分、合成法以及生物酶拆分。其中，化学法，即利用对映体的物理和化学性质的差异进行分离，通常有盐析法、包结法、以及组合拆分。其缺点是要求对映体之间的性质差异要大，适用的化合物不多；色谱拆分，这种方法是利用填料对手性对映体吸附性质的差异来实现，其缺点是设备昂贵，普及性较差；合成法，通过设计反应来进行手性化合物的化学合成。这种方法缺点在于反应过程通常比较剧烈，耗费能量，而且反应中使用大量有毒的有机溶剂；生物酶具有立体位点区域和底物的高度专一性，利用酶促反应催化具有反应条件温和、位点选择性强、副反应少、光学纯度高以及环境污染小等优点。生物酶拆分也是目前手性药物发展的一个朝阳方向，因此开发具有光学选择性的酯酶具有重要的意义。
技术实现思路
本专利技术的针对现有技术中酯酶价格昂贵、生产技术受到制约的不足，提供一种新的酯酶PHE14及其编码基因和应用。本专利技术从一株海洋假单胞菌(Pseudomonadaceaeoryzihabitans)HUP022中开发了一种新的酯酶PHE14及其编码基因PHE14，构建了含有PHE14的重组表达载体和基因工程菌，培养基因工程菌后获得酯酶PHE14，其可应用于制备手性乳酸甲酯。本专利技术的第一个目的是提供一种酯酶PHE14，其氨基酸序列如SEQIDNO.2所示。本专利技术的第二个目的是提供一种编码所述的酯酶PHE14的酯酶基因PHE14。优选，所述的酯酶基因PHE14的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示。本专利技术还提供一种含有所述的酯酶基因PHE14的重组表达载体。所述的表达载体，优选pET28a(+)载体。本专利技术还提供一种含有所述的酯酶基因PHE14的基因工程菌。所述的基因工程菌，优选大肠杆菌BL21(DE3)。本专利技术的第三个目的是提供所述的酯酶PHE14在制备手性乳酸甲酯中的应用。优选，酯酶PHE14在拆分(±)-乳酸甲酯制备得到(S)-乳酸甲酯中的应用。进一步优选，其步骤为：取酯酶PHE14于pH为6.0-10.0的缓冲液中，再加入(±)-乳酸甲酯，进行反应，得到(S)-乳酸甲酯。所述的缓冲液，优选为柠檬酸/柠檬酸钠、磷酸缓冲液、Tris/HCl和Gly/NaOH缓冲液中的一种。本专利技术还提供了酯酶PHE14在耐受有机溶剂或表面活性剂环境下进行催化的应用。所述的有机溶剂优选为二氯甲烷、三氯甲烷、正己烷、环己烷、正庚烷、正辛烷、正葵烷、甲醇、乙醇、正庚醇、正葵醇、丙酮、DMF、DMSO、甲苯或四氢呋喃。所述的表面活性剂优选为Tween-20或三聚磷酸钠。本专利技术的酯酶基因PHE14来自深海样品中筛选得到的一株海洋假单胞菌(Pseudomonadaceaeoryzihabitans)HUP022，保存在中国科学院南海海洋研究所实验室。本专利技术用生物信息学分析的方法，从基因组测序的假单胞菌(Pseudomonadaceaeoryzihabitans)HUP022中筛选得到酯酶基因PHE14，全长为645bp(从起始密码子到终止密码子)，其编码的酯酶PHE14含有214个氨基酸。通过克隆编码酯酶PHE14的酯酶基因PHE14并将其连接表达载体pET-28a(+)后转化大肠杆菌BL21(DE3)，培养并诱导表达后，得到了重组表达的酯酶PHE14。酯酶PHE14可用于制备手性乳酸甲酯，利用重组表达的酯酶PHE14作为催化剂，制备得到了光学纯度大于99％的(S)-乳酸甲酯。酯酶PHE14在生物化工和生物医药等领域具有非常大的应用价值。附图说明图1是酯酶PHE14对不同侧链长度的对硝基苯酚酯的酶活。图2是酯酶PHE14的最适pH及pH稳定性。图3是酯酶PHE14的最适反应温度和温度稳定性。其中，A为最适反应温度曲线图，B为温度稳定性曲线图。图4是不同浓度NaCl或KCl对酯酶PHE14酶活性影响。其中，A为NaCl对酯酶PHE14酶活性影响曲线图，B为KCl对酯酶PHE14酶活性影响曲线图。图5是酯酶PHE14拆分(±)-乳酸甲酯反应GC图。A为(±)-乳酸甲酯气相图，B为酯酶PHE14拆分(±)-乳酸甲酯反应1.0h后的气相图，其中S代表(S)-乳酸甲酯，R代表(R)-乳酸甲酯。图6是酯酶PHE14的蛋白表达纯化情况。其中，M为蛋白Marker，1和3为未经IPTG诱导的含有pET-28a(+)-PHE14的大肠杆菌BL21(DE3)，2为经IPTG诱导的含有pET-28a(+)-PHE14的大肠杆菌BL21(DE3)，4为Ni柱纯化后得到的酯酶PHE14，5为经过脱盐柱后的酯酶PHE14。具体实施方式以下实施例是对本专利技术的进一步说明，而不是对本专利技术的限制。下列实例中未具体注明的实验方法，均可按照常规方法进行，或按照所用产品生产厂商的使用说明。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可通过商业途径得到。本专利技术的酯酶基因PHE14来自深海样品中筛选得到的一株海洋假单胞菌(Pseudomonadaceaeoryzihabitans)HUP022，该菌保存在中国科学院南海海洋研究所实验室。实施例1：酯酶基因PHE14引物设计及开放阅读框边界确定提取假单胞菌(Pseudomonadaceaeoryzihabitans)HUP022的基因组DNA，本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种酯酶PHE14，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

【技术特征摘要】
1.一种酯酶PHE14，其特征在于，其氨基酸序列如SEQIDNO.2所示。
2.一种编码权利要求1所述的酯酶PHE14的酯酶基因PHE14。
3.根据权利要求2所述的酯酶基因PHE14，其特征在于，其核苷酸序列如SEQIDNO.1所
示。
4.权利要求1所述的酯酶PHE14在制备手性乳酸甲酯中的应用。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，酯酶PHE14在拆分(±)-乳酸甲酯制备得到(S)-
乳酸甲酯中的应用。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，取酯酶PHE14于pH为6.0-10.0的缓冲液中，
再加入(±)-乳酸甲酯，进行反...

【专利技术属性】
技术研发人员：胡云峰，王依龙，张云，
申请(专利权)人：中国科学院南海海洋研究所，
类型：发明
国别省市：广东;44