本发明专利技术提供了一种立体选择性酯酶、编码基因、载体、工程菌及其拆分(R,S)‑N‑(2，6‑二甲基苯基)氨基丙酸甲酯的应用；利用重组大肠杆菌或重组酯酶为生物催化剂同时催化拆分(R,S)‑N‑(2，6‑二甲基苯基)氨基丙酸甲酯，生成(R)‑N‑(2，6‑二甲基苯基)氨基丙酸，转化率达49.8％，产物光学纯度都在98％以上。
【技术实现步骤摘要】
(一)
本专利技术涉及一种立体选择性酯酶及其编码基因，含有该编码基因的载体、工程菌及其应用。(二)
技术介绍
(R)-N-(2，6-二甲基苯基)氨基丙酸((R)-MAP-acid)是一种重要的手性化工原料和医药中间体，广泛的应用于手性合成领域，特别是在手性农药制备方面，其需求量在飞速的增长。(R)-N-(2，6-二甲基苯基)氨基丙酸经甲酯化以后得到的(R)-N-(2，6-二甲基苯基)氨基丙酸甲酯((R)-DMPM)是制备精甲霜灵的关键中间体。目前通过拆分甲霜灵的外消旋体制备单一构型旋光体的工艺还不适宜大量生产，虽然也可以采用以L-乳酸为原料的手性合成方案，大规模工业化生产，但是由于需要经过繁琐复杂的化学合成步骤，不仅工业生产上费时费力，而且化学反应条件强烈，对环境污染比较严重，不符合人们绿色化学的要求，最重要的是此化学合成产品的最终光学纯度未能达到95％。因此，随着生物手性拆分技术发展，以上这些化学合成方法，必将被反应条件温和，环境友好的生物催化法所取代。用于生物法制备(R)-DMPM的生物催化剂既可以是整细胞，也可以是酶。因为细胞内含有多种酶，整细胞催化往往会遇到副反应的问题，副反应的存在会降低目标反应产物的得率。对于拆分(R,S)-DMPM这种一步反应来说，酶法催化更具优势，既可以彻底避免副反应的问题，也可以克服细胞膜阻碍底物和产物跨膜传递的问题。因而，通过基因工程技术高产酯酶，将为其在生物法拆分(R,S)-DMPM中的应用奠定良好的基础。酯酶(Esterases，EC3.1.1.X)是一类催化酯键(羧酯键、酰胺键、硫酯键等)水解和合成的酶。工业应用的酯酶多数来自微生物，这类微生物从分类上看主要是真菌，主要包括黑曲霉、链孢霉、青霉、黄曲霉、毛霉、犁头菌、红曲霉、根霉、白地霉、核盘菌、酵母菌和须霉等12属23种；其次是细菌，包括伯克霍尔德属、葡萄球菌属、假单胞菌属及芽孢杆菌属等；此外，放线菌中也存在个别种属可以产一定量的酯酶。这些野生菌中酯酶含量较低并且比较杂，利用其作为生物催化剂进行大规模的工业化生产存在一定的难度，因而构建酯酶基因工程菌从而大量生产重组酯酶具有十分重要意义。(三)
技术实现思路
本专利技术目的是提供一种立体选择性酯酶、编码基因、含有该基因的重组载体、该重组载体转化得到的重组基因工程菌，及其在生物法拆分(R,S)-N-(2，6-二甲基苯基)氨基丙酸甲酯中的应用，解决了精甲霜灵中间体制备过程中中间体(R)-DMPM的ee.值达不到98％以上的技术难题，比利用进口商品脂肪酶拆分制备该化合物在催化剂成本上节省了80％以上。本专利技术采用的技术方案是：一种立体选择性酯酶，其氨基酸序列如SEQIDNo.1所示。SEQIDNo.1：由于氨基酸序列的特殊性，任何含有SEQIDNO.1所示氨基酸序列的多肽的片段或其变体，如其保守性变体、生物活性片段或衍生物，只要该多肽的片段或多肽变体与前述氨基酸序列同源性在90％以上、且具有相同的酶活性，均属于本专利技术保护范围之列。具体的，所述改变可包括氨基酸序列中氨基酸的缺失、插入或替换；其中，对于变体的保守性改变，所替换的氨基酸具有与原氨基酸相似的结构或化学性质，如用亮氨酸替换异亮氨酸，变体也可具有非保守性改变，如用色氨酸替换甘氨酸。本专利技术所述蛋白的片段、衍生物或类似物是指基本上保持本专利技术所述的蛋白酶相同的生物学功能或活性的蛋白，可以是下列情形：(Ⅰ)一个或多个氨基酸残基被保守或非保守氨基酸残基(优选的是保守氨基酸残基)取代，并且取代的氨基酸可以是也可以不是由遗传密码子编码的；(Ⅱ)一个或多个氨基酸残基上的某个基团被其它基团取代；(Ⅲ)成熟蛋白与另一种化合物(比如延长蛋白半衰期的化合物，例如聚乙二醇)融合；(Ⅳ)附加的氨基酸序列融合进成熟的蛋白而形成的蛋白序列(如用来纯化此蛋白的序列或蛋白原序列)。所述蛋白可以是重组蛋白、天然蛋白或合成蛋白，可以是纯天然纯化的产物，或是化学合成的产物，或使用重组技术从原核或真核宿主(例如：细菌、酵母、高等植物、昆虫和哺乳动物细胞)中产生。根据重组生产方案所用的宿主，本专利技术的蛋白可以是糖基化的。本专利技术的蛋白还可以包括或不包括起始的甲硫氨酸残基。本专利技术还涉及所述立体选择性酯酶的编码基因，具体的，所述编码基因的核苷酸序列如SEQIDNo.2所示：该立体选择性酯酶基因由如下方法得到：从不解糖假苍白杆菌WZZ003(Pseudochrobactrumasaccharolyticum)中分离纯化得到该立体选择性酯酶基因，N端测序结果经比对获得相似度最高的同源基因序列，设计引物1(5’-ATGCAAAAACAGCATGTTGAAAC-3’)、引物2(5’-TTAACCGCGCAGGAAACG-3’)。利用PCR技术，以来源于不解糖假苍白杆菌WZZ003的基因组DNA为模板克隆酯酶基因片段。将该片段连接到pEASY-E2载体上获得克隆载体pEASY-E2-Est并将其转化于大肠杆菌Trans1-T1中。对重组质粒测序，并利用软件对测序结果进行分析，该序列含有一个长为813bp的开放阅读框(SEQIDNO.2)，利用软件对该基因序列进行分析，推知所述立体选择性酯酶基因编码的氨基酸序列如SEQIDNO.1所示。所述立体选择性酯酶基因源自不解糖假苍白杆菌WZZ003(PseudochrobactrumasaccharolyticumWZZ003)。该菌保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国武汉，武汉大学，430072，保藏编号：CCTCCNo:M2014209，保藏日期：2014年5月23日，已在先前申请专利(申请号：201510134861.3)中提交了相关菌种保藏信息并披露了其遗传资源来源。由于核苷酸序列的特殊性，任何SEQIDNO.2所示多核苷酸的变体，只要其与该多核苷酸具有70％以上同源性、且具有相同的功能，均属于本专利技术保护范围之列。所述多核苷酸的变体是指一种具有一个或多个核苷酸改变的多核苷酸序列。此多核苷酸的变体可以是天然发生的等位变异体或非天然发生的变异体，包括取代变异体、缺失变异体和插入变异体。如本领域所知的，等位变异体是一个多核苷酸的替换形式，它可能是一个或多个核苷酸的取代、缺失或插入，但不会从实质上改变其编码的氨基酸的功能。另外，可与SEQIDNO：2所示多核苷酸序列杂交的多核苷酸(至少具有50％同源性，优选具有70％同源性)，也在本专利技术保护范围之列，特别是在严格条件...
【技术保护点】
一种立体选择性酯酶，其特征在于所述酯酶的氨基酸序列为SEQ ID No.1所示。
【技术特征摘要】
1.一种立体选择性酯酶，其特征在于所述酯酶的氨基酸序列为SEQID
No.1所示。
2.一种权利要求1所述立体选择性酯酶的编码基因，其特征在于所
述编码基因的核苷酸序列为SEQIDNo.2所示。
3.一种权利要求2所述编码基因构建的重组载体。
4.一种权利要求3所述重组载体转化得到的重组基因工程菌。
5.一种权利要求2所述编码基因在制备立体选择性酯酶中的应用。
6.一种权利要求1所述立体选择性酯酶在催化拆分(R,S)-N-(2，6-二
甲苯基)氨基丙酸甲酯中的应用。
7.如权利要求6所述的应用，其特征在于所述应用以含立体选择性
酯酶编码基因的工程菌经发酵培养获得的湿菌体为催化剂，以(R,S)-N-(2，
6-二甲苯基)氨基丙酸甲酯为底物，以pH6.0、0.2M的磷酸盐缓冲液为反
应介质，在30℃，200rpm条件下进行拆分反应，反应结束后，反应液先
用乙酸乙酯萃，分离后的水相经盐酸酸化、乙酸乙酯萃取，旋蒸后得到
(R)-N-(2，6-二甲基苯基)氨基丙酸。
8.如权利要求7所述的应用，其特征在于所述催化剂质量用量以缓
冲液体积计为2...
【专利技术属性】
技术研发人员：章银军，汪钊，郑建永，应向贤，刘胤延，
申请(专利权)人：浙江工业大学，
类型：发明
国别省市：浙江;33
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