一种联产长链二元酸和1,3‑丙二醇的工程菌及其构建方法技术

本发明专利技术涉及一种联产长链二元酸和1,3‑丙二醇的工程菌及其构建方法，通过转化重组质粒制备，重组质粒通过PCR扩增获得甘油脱水酶基因，与PCR扩增获得的启动子pGAPg重叠连接，获得pGAPg‑GD片段；通过PCR扩增获得1,3‑丙二醇脱氢酶基因与PCR扩增获得的启动子pGAPp重叠连接，获得pGAPp‑PDE片段；通过PCR扩增获得的终止子基因，并制备双向终止子片段；分别连接上述片段，获得重组质粒。本发明专利技术构建的工程菌，实现多基因同时表达；并且长链二元酸的产量为10g/L，转化甘油产生的1,3‑丙二醇的产量为13g/L，显著高于现有已知的报道。

Engineering bacteria for coproduction of long chain dicarboxylic acid and 1,3 propylene glycol and its construction method

The invention relates to a kind of engineering bacteria and long chain dicarboxylic acid and 1,3 propylene glycol and its construction method, through the transformation of the recombinant plasmid preparation, the recombinant plasmid was amplified by PCR of glycerol dehydratase gene, and PCR amplified pGAPg promoter overlap connection, pGAPg GD fragment was amplified by PCR 1,3; propylene glycol dehydrogenase gene was amplified by PCR and promoter pGAPp pGAPp overlap connection, PDE fragment was amplified by PCR; the terminator gene, and preparation of bidirectional terminator fragment; respectively connected with the fragment, recombinant plasmid. The engineering bacteria constructed by multi genes and expression; and long chain dicarboxylic acid yield was 10g/L, conversion of glycerol produced 1,3 propylene glycol production was 13g/L, significantly higher than that of the existing known reports.

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种联产长链二元酸和1,3-丙二醇的工程菌及其构建方法，特别涉及一种转化油脂联产长链二元酸和1,3-丙二醇热带假丝酵母工程菌及其构建方法与应用，属于生物工程

技术介绍
长链二元酸是指碳链中含有10个以上碳原子的直链脂肪族二元羧酸。重要的精细化工中间体，可以合成香料、特种尼龙、聚酰胺热熔胶等一系列高附加值的特殊化学品，目前国内外生产长链二元酸主要有2种方法：化学法和发酵法。与微生物发酵法相比，化学法生产长链二元酸条件苛刻、工艺复杂、不够环保，且产品质量差，因此众多研究者将目标转向有广阔发展前景、工业价值大的微生物发酵上来。微生物发酵法是以正构烷烃为原料，利用热带假丝酵母菌(Candidatropicalis)的氧化性能，在常温常压下氧化正构烷烃两端的甲基，生成基质烷烃相应链长的二元酸。由于长链二元酸的下游产品的开发潜力广阔，国内长链二元酸的需求量将不断增加，其市场潜力极大。国内已经实现了热带假丝酵母以烷烃为底物生成长链二元酸的发酵手段，如中国专利文献CN103074325A(申请号201310045582.0)中国专利文献CN102839133A(申请号201110168672X)中国专利文献CN102115766A(申请号2009102565871)中国专利文献CN102115766B(申请号2009102565871)中国专利文献CN1614004A(申请号200410096698.8)中国专利文献CN103805642A(申请号2012104397995)中国专利文献CN102115769A(申请号:2009102565907)中国专利文献CN102115765A(申请号2009102565867)中国专利文献CN1844404A(申请号200610038331X)。1,3-丙二醇(1，3-propanediol，简称1，3-PD)是一种重要的化工原料，被广泛应用于印染、涂料、油墨、药物、抗冻剂、润滑剂等领域，尤其作为单体合成新型聚酯材料PTT(聚对苯二甲酸丙二醇酯)受到人们广泛关注。可用于多种药物、新型聚酯PTT、医药中间体及新型抗氧化剂的合成，还可用，溶剂，有机合成，气象色谱分析标准。1，3-PD的生产方法主要有化学合成和微生物发酵法，由于石化资源的短缺，近年来微生物发酵法生产1，3-PD成为国内外研究的热点。现在国内已实现了克雷伯氏菌以甘油为底物发酵生产1,3-丙二醇的方法如中国专利文献CN102604863A(申请号201210053231X)中国专利文献CN102604863B(申请号201210053231X)中国专利文献CN101633928B(申请号2008102282685)中国专利文献CN101260379B(申请号200810024000X)中国专利文献CN103497922A(申请号2013104091486)中国专利文献CN103497922B(申请号2013104091486)虽然现在有热带假丝酵母发酵生产长链二元酸和克雷伯氏菌发酵产1,3-丙二醇的单独发酵方案，还没有通过同一菌株发酵同时生产长链二元酸和1,3-丙二醇相关报道。
技术实现思路
本专利技术针对现有技术的不足，提供一种联产长链二元酸和1,3-丙二醇的工程菌及其构建方法。本专利技术技术方案如下：一种重组质粒，通过从丁酸梭菌中经PCR扩增获得甘油脱水酶基因，然后与从热带假丝酵母中经PCR扩增获得的启动子pGAPg重叠连接，获得pGAPg-GD片段；通过经PCR扩增获得的1,3-丙二醇脱氢酶基因与从热带假丝酵母中经PCR扩增获得的启动子pGAPp重叠连接，获得pGAPp-PDE片段；通过从质粒上PCR扩增获得的终止子基因，经反向连接，获得双向终止子片段；分别向质粒中插入pGAPg-GD片段、pGAPp-PDE片段、双向终止子片段及Kanr基因片段，获得重组质粒；所述启动子pGAPg核苷酸序列如SEQIDNO.1所示，启动子pGAPp核苷酸序列如SEQIDNO.2所示，所述的甘油脱水酶基因核苷酸序列如SEQIDNO.3所示，1,3-丙二醇脱氢酶基因核苷酸序列如SEQIDNO.4所示；所述终止子基因核苷酸序列如SEQIDNO.5所示，所述的Kanr基因核苷酸序列如SEQIDNO.6所示。上述重组质粒实现了甘油脱水酶和1,3-丙二醇脱氢酶分别连接在双向终止子两端的整合，同时重组质粒上获得抗生素标记Kanr的序列。上述重组质粒的制备方法，包括如下步骤：(1)以热带假丝酵母基因组为模板，进行PCR扩增，获得启动子pGAPg片段；所述PCR扩增的引物核苷酸序列如下：pGAPg-up:5’-AGATCTAAGAAGAATTTAGTGGTTAGTCG-3’，pGAPg--down:5’-ATCCTTTACTTATCATTGTTAAAATTTAATTTGTAAGTGATTTG-3’；其中单下划线为酶切位点BglII；(2)以热带假丝酵母基因组DNA为模板，进行PCR扩增，得到启动子pGAPp片段；所述PCR扩增的引物核苷酸序列如下：pGAPp-up:5’-AGATCTAAGAAGAATTTAGTGGTTAGTCG-3’；pGAPp-down:5’-TCAAACATACGATAGCTCATTGTTAAAATTTAATTTGTAAGTGATTTG-3’；其中单下划线为酶切位点BglII；(3)以丁酸梭菌的基因组为模板，进行PCR扩增，得到甘油脱水酶GD片段；所述PCR扩增的引物核苷酸序列如下：GD-up:5’-CAAATTAAATTTTAACAATGATAAGTAAAGGATTTAGTACCC-3’，GD-down:5’-GGATCCTTACATAACATGTTCAGTTCTTGC-3’；其中单下划线为酶切位点BamHI；(4)以克雷伯氏菌的基因组为模板，进行PCR扩增，得到1,3-丙二醇脱氢酶PDE片段；所述PCR扩增的引物核苷酸序列如下：PDE-up:5’-TTTAACAATGAGCTATCGTATGTTTGATT-3’，PDE-down:5’-GATTTTCCGCCAGGCATTCTGAGGATCC-3’；其中单下划线为酶切位点BamHI；(5)以质粒Kanr9k为模板，进行PCR扩增，得到终止子pTTza片段；所述PCR扩增的引物核苷酸序列如下：pTTza-up:5’-AGATCTGTTTGTAGCCTTAGACATGACTG-3’；pTTza-down:5’-GGATCCGCACAAACGAAGG-3’；其中单下划线为酶切位点BglII；(6)以大肠杆菌的基因组为模板，进行PCR扩增，得到抗性标记Kanr片段；所述PCR扩增的引物核苷酸序列如下：pKanr9k-up:5’-AGATCTTGAGGGAGCCACGGTTGAT-3’pKanr9k-down:5’-GGATCCGGTTGAGGCCGTTGAGCA-3’其中单下划线分别为酶切位点BglII，酶切位点BamHI。(7)将步骤(1)制得的启动子pGAPg片段与步骤(3)制得的甘油脱水酶片段GD进行PCR重叠连接，制得pGAPg-GD片段；(8)将步骤(2)制得的启动子pGAPp片段与步骤(4)制得的1,3-丙二醇脱氢酶片段PDE进行PCR重叠连接本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种重组质粒，通过从丁酸梭菌中经PCR扩增获得甘油脱水酶基因，然后与从热带假丝酵母中经PCR扩增获得的启动子pGAPg重叠连接，获得pGAPg‑GD片段；通过经PCR扩增获得的1,3‑丙二醇脱氢酶基因与从热带假丝酵母中经PCR扩增获得的启动子pGAPp重叠连接，获得pGAPp‑PDE片段；通过从质粒上PCR扩增获得的终止子基因，经反向连接，获得双向终止子片段；分别向质粒中插入pGAPg‑GD片段、pGAPp‑PDE片段、双向终止子片段及Kanr基因片段，获得重组质粒；所述启动子pGAPg核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，启动子pGAPp核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，所述的甘油脱水酶基因核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，1,3‑丙二醇脱氢酶基因核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；所述终止子基因核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示，所述的Kanr基因核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示。

【技术特征摘要】
1.一种重组质粒，通过从丁酸梭菌中经PCR扩增获得甘油脱水酶基因，然后与从热带假丝酵母中经PCR扩增获得的启动子pGAPg重叠连接，获得pGAPg-GD片段；通过经PCR扩增获得的1,3-丙二醇脱氢酶基因与从热带假丝酵母中经PCR扩增获得的启动子pGAPp重叠连接，获得pGAPp-PDE片段；通过从质粒上PCR扩增获得的终止子基因，经反向连接，获得双向终止子片段；分别向质粒中插入pGAPg-GD片段、pGAPp-PDE片段、双向终止子片段及Kanr基因片段，获得重组质粒；所述启动子pGAPg核苷酸序列如SEQIDNO.1所示，启动子pGAPp核苷酸序列如SEQIDNO.2所示，所述的甘油脱水酶基因核苷酸序列如SEQIDNO.3所示，1,3-丙二醇脱氢酶基因核苷酸序列如SEQIDNO.4所示；所述终止子基因核苷酸序列如SEQIDNO.5所示，所述的Kanr基因核苷酸序列如SEQIDNO.6所示。2.权利要求1所述重组质粒的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)以热带假丝酵母基因组为模板，进行PCR扩增，获得启动子pGAPg片段；所述PCR扩增的引物核苷酸序列如下：pGAPg-up:5’-AGATCTAAGAAGAATTTAGTGGTTAGTCG-3’，pGAPg--down:5’-ATCCTTTACTTATCATTGTTAAAATTTAATTTGTAAGTGATTTG-3’；(2)以热带假丝酵母基因组DNA为模板，进行PCR扩增，得到启动子pGAPp片段；所述PCR扩增的引物核苷酸序列如下：pGAPp-up:5’-AGATCTAAGAAGAATTTAGTGGTTAGTCG-3’；pGAPp-down:5’-TCAAACATACGATAGCTCATTGTTAAAATTTAATTTGTAAGTGATTTG-3’；(3)以丁酸梭菌的基因组为模板，进行PCR扩增，得到甘油脱水酶GD片段；所述PCR扩增的引物核苷酸序列如下：GD-up:5’-CAAATTAAATTTTAACAATGATAAGTAAAGGATTTAGTACCC-3’，GD-down:5’-GGATCCTTACATAACATGTTCAGTTCTTGC-3’；(4)以克雷伯氏菌的基因组为模板，进行PCR扩增，得到1,3-丙二醇脱氢酶PDE片段；所述PCR扩增的引物核苷酸序列如下：PDE-up:5’-TTTAACAATGAGCTATCGTATGTTTGATT-3’，PDE-down:5’-GATTTTCCGCCAGGCATTCTGAGGATCC-3’；(5)以质粒Kanr9k为模板，进行PCR扩增，得到终止子pTTza片段；所述PCR扩增的引物核苷酸序列如下：pTTza-up:5’-AGATCTGTTTGTAGCCTTAGACATGACTG-3’；pTTza-down:5’-GGATCCGCACAAACGAAGG-3’；(6)以大肠杆菌的基因组为模板，进行PCR扩增，得到抗性标记Kanr片段；所述PCR扩增的引物核苷酸序列如下：pKanr9k-up:5’-AGATCTTGAGGGAGCCACGGTTGAT-3’；pKanr9k-down:5’-GGATCCGGTTGAGGCCGTTGAGCA-3’；(7)将步骤(1)制得的启动子pGAPg片段与步骤(3)制得的甘油脱水酶片段GD进行PCR重叠连接，制得pGAPg-GD片段；(8)将步骤(2)制得的启动子pGAPp片段与步骤(4)制得的1,3-丙二醇脱氢酶片段PDE进行PCR重叠连接，制得pGAPp-PDE片段；(9)将步骤(5)制得的终止子pTTza片段进行终止子间的反向连接；(10)将步骤(6)中得到的pKanr9k片段，步骤(7)中制得的pGAPg-GD片段，步骤(8)中制得的pGAPg-PDE片段，分别与Ptopo-Blunt-Vector载体连接，制得Ptopo-Blunt-pKanr9k，Ptopo-Blunt-pGAPg-GD，Ptopo-Blunt-pGAPg-PDE质粒；(11)将步骤(10)制得的Ptopo-Blunt-pGAPg-GD质粒用限制性内切酶BamHI单酶切，然后将单酶切后的质粒去磷酸化；(12)将步骤(10)制得的Ptopo-Blunt-pGAPp-PDE质粒进行双酶切，所用酶为限制性内切酶BglII和BamHI，并回收双酶切产物pGAPp-PDE；(13)将步骤(9)制得的pTOPO-Blunt-pTTza-pTTza质粒进行双酶切，所用酶为限制性内切酶BglII和BamHI，并回收切下的pTTza-pTTz片段；(14)将步骤(10)制得的Ptopo-Blunt-pKanr9k质粒进行双酶切，所用酶为限制性内切酶BglII和BamHI，并回收切下的pKanr9k片段；(15)将步骤(13)制得的pTTza-pTTza片段连接到步骤(11)制得的磷酸化后的单酶切载体上，制得Ptopo-Blunt-pGAPg-GD-pTTza载体；(16)将步骤(15)制得的Ptopo-Blunt-pGAPg-GD-pTTza载体进行单酶切，所用酶为限制性内切酶BamHI，将回收的单酶切产物去磷酸化；(17)将步骤(12)制得的pGAPp-PDE片段连接到步骤(16)制得的磷酸化后的单酶切载体上；(18)将步骤(17)所得的重组载体单酶切，所用酶为限制性内切酶BglII，将回收的单酶切产物去磷酸化；(19)将步骤(14)所得的Kanr片段连接到步骤(18)中的单酶切载体上获得最终构建的基因重组载体Ptopo-GD-PDE-Kanr。3.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(1)中，PCR扩增的扩增体系如下，体系总体积50μl：2×HiFi-PCRMaster25μl，10μmol/L上游引物2μl，10μmol/L下游引物2μl，模板2.5μl，用ddH2O补足至50μl；所述的PCR扩增的扩增程序如下：95℃预变性5min；95℃变性30sec，52℃退火30sec，72℃延伸2min，30个循环；72℃延伸10min，-20℃保存；优选的，所述步骤(2)中，PCR扩增的扩增体系如下，体系总体积50μl：2×HiFi-PCRMaster25μl，10μmol/L上游引物2μl，10μmol/L下游引物2μl，模板2.5μl，用ddH2O补足至50μl；所述的PCR扩增的扩增程序如下：95℃预变性5min；95℃变性30sec，52℃退火30sec，72℃延伸2min，30个循环；72℃延伸10min，-20℃保存。4.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(3)中，PCR扩增的扩增体系如下，体系总体积50μl：2×TaqPCRMasterMix25μl，10μmol/L上游引物2μl，10μmol/L下游引物2μl，模板2.5μl，用ddH2O补足至50μl；所述的PCR扩增的扩增程序如下：95℃预变性5min；95℃变性30sec，53℃退火30sec，72℃延伸2.5min，30个循环；72℃延伸10min，-20℃保存；优选的，所述步骤(4)中，PCR扩增的扩增体系如下，体系总体积50μl：2×HiFi-PCRMaster25μl，10μmol/L上游引物2μl，10μmol/L下游引物2μl，模板2.5μl，用ddH2O补足至50μl；所述的PCR扩增的扩增程序如下：95℃预变性5min；95℃变性30sec，53℃退火30sec，72℃延伸2.5min，3...

【专利技术属性】
技术研发人员：汪俊卿，郭维伟，彭健，王瑞明，杨晓慧，石莹，程成，修翔，
申请(专利权)人：齐鲁工业大学，
类型：发明
国别省市：山东;37