本发明专利技术属于基因工程领域，公开了一种脂肪酶，其氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。将其其编码基因与表达载体连接构建得到含该基因的胞内表达重组质粒，再转化至大肠杆菌菌株中，获得重组大肠杆菌，可以利用重组大肠杆菌细胞为催化剂进行生物催化生产普瑞巴林关键手性中间体制备(3S)‑2‑羧乙基‑3‑氰基‑5‑甲基己酸。本发明专利技术获得的脂肪酶对2‑羧乙基‑3‑氰基‑5‑甲基己酸乙酯具有极高的对映选择性，具有很好的工业应用前景。
Lipase gene, vector, engineering bacteria and application thereof
The invention belongs to the field of gene engineering, and discloses a lipase, its amino acid sequence is shown as SEQ ID NO:2. The expression of the gene encoding plasmid to construct the recombinant plasmid containing the gene in the cell, and then transformed into Escherichia coli strain, the recombinant Escherichia coli can be as catalyst for the biocatalytic production of key chiral intermediates in the preparation of pregabalin by recombinant Escherichia coli cells (3S) 2 carboxyethyl 3 cyano 5 methyl hexanoate. The 2 carboxyethyl lipase of 3 cyano 5 methyl ethyl caproate with high enantioselectivity, has good prospects for industrial applications.
【技术实现步骤摘要】
(一)
本专利技术涉及一种脂肪酶的基因、含有该基因的重组载体、该重组载体转化得到的基因工程菌，本专利技术还涉及所述的脂肪酶在制备(35)-2-羧乙基-3-氰基-5-甲基己酸中的应用。(二)
技术介绍
脂肪酶(lipase，EC3.1.1.3)，系统名称为三脂酰甘油酰基水解酶(triacylglycerolacylhydrolase)，是一类催化三酯酰甘油的酯键水解的酶。脂肪酶具有多种催化功能，除能催化酯水解，还具有催化酯合成、转酯化、氨解、醇解等反应，在食品、洗涤、饲料、制革、生物能源、油脂加工、有机合成和对映体拆分等领域应用广泛。脂肪酶催化的反应除具有选择性高、副反应少，产物光学纯度高等特点外，还具有催化反应条件温和、绿色环保等优越性，这使得脂肪酶在光学纯化合物特别是手性药物的制备中具有独特的优势。脂肪酶生物催化已成为重要的手性化学品合成、特别是手性药物制备的重要技术手段。脂肪酶广泛存在于自然界中的各种生物体内，其中来源于微生物的脂肪酶容易获得、种类最多，且与动植物来源的脂肪酶相比，具有更广的温度和pH值适应范围，并且底物谱广，催化选择性高，因而微生物成为工业脂肪酶的重要来源。不同微生物来源的脂肪酶，通常具有不同的分子结构和催化特性。如来源于嗜热菌的热稳定脂肪酶，一般具有较强的溶剂稳定性，具有很好的生物技术和工业应用潜力。从嗜热菌中获得热稳定酶已成为学术界和工业界的研究热点。部分嗜热菌的脂肪酶基因已被克隆表达，并获得产酶活力较高的基因工程菌，但是在对已有脂肪酶进行研究的同时，开发新的、具有应用价值的微生物来源的脂肪酶是研究的热点，具有重要意义。(三)专利
技术实现思路
本专利技术目的是提供一种脂肪酶、编码该酶的基因、含有该基因的重组载体、该重组载体转化得到的重组基因工程菌，及其在立体选择性水解2-羧乙基-3-氰基-5-甲基己酸乙酯制备普瑞巴林关键手性中间体(3S)-2-羧乙基-3-氰基-5-甲基己酸中的应用。本专利技术采用的技术方案是：本专利技术提供一种来源于嗜热真菌TalaromycesdupontiiATCC16461的脂肪酶，所述脂肪酶的氨基酸序列为SEQIDNO：2所示，其中1-22aa(MRSSLVLFFISAWTALARPVRR)为信号肽序列，其成熟肽由269aa组成。所述SEQIDNO：2所示氨基酸序列为：任何对SEQIDNO：2所示氨基酸序列中氨基酸进行缺失、插入或替换的处理获得的多肽片段或其变体，只要其与SEQIDNO：2所示氨基酸序列具有95％以上同源性，均属于本专利技术的保护范围。本专利技术还提供一种编码所述脂肪酶的基因，所述编码基因的核苷酸序列为SEQIDNO：1所示。该脂肪酶基因由如下方法得到：采用RT-PCR从TalaromycesdupontiiATCC16461菌中分离脂肪酶基因。采用TRIzol法提取T.dupontiiATCC16461总RNA，使用RT-PCRKit进行cDNA第一链的合成，反应体系及条件均参照试剂盒的使用说明。然后利用根据Thermomyceslanuginosus脂肪酶Ln(EU004196.1)的信号肽编码序列设计的引物，利用脂肪酶TLL(EU022703.1)、Ln(EU004196.1)和TTL(JF414585.1)的中间高同源性序列设计引物，PCR获得约600bp的5′-端脂肪酶序列。在此基础上，利用3′-RACE(RapidAmplificationofcDNAEnds)，扩增约650bp的3′-端脂肪酶编码序列，并进行序列分析、拼接，获得了一个长为876bp的开放阅读框(SEQIDNO：1)。所述SEQIDNO：1所示的核苷酸序列为：任何对SEQIDNO：1所示核苷酸序列进行一个或多个核苷酸的取代、缺失或插入处理获得的核苷酸序列，只要其与该核苷酸具有95％以上的同源性，均属于本专利技术的保护范围。本专利技术提供一种含有所述脂肪酶编码基因的重组载体，及含有所述脂肪酶编码基因的重组基因工程菌。根据脂肪酶成熟肽编码序列，设计并合成引物，以cDNA为模板PCR克隆脂肪酶成熟肽基因序列，然后用限制性酶NcoI/XhoI进行双酶切，切胶回收后与同样酶切处理回收的pET-28b连接，构建了含有脂肪酶基因的重组质粒pET28-TDL。将重组质粒pET28-TDL转化至E.coliBL21(DE3)菌株中，获得工程菌E.coliBL21(DE3)/pET28-TDL。本专利技术提供一种所述脂肪酶编码基因在制备脂肪酶中的应用，所述方法为：构建含有所述脂肪酶编码基因的重组载体，将所述重组载体转化至大肠杆菌中，获得的基因工程菌进行诱导培养，从培养液分离得到含有重组脂肪酶的菌体细胞。此外，本专利技术还涉及一种所述来源于TalaromycesdupontiiATCC16461的脂肪酶在制备普瑞巴林关键手性中间体(3S)-2-羧乙基-3-氰基-5-甲基己酸中应用，具体所述的应用以含有该脂肪酶的工程菌菌体或者湿菌体分离提取的酶作为酶源，以外消旋2-羧乙基-3-氰基-5-甲基己酸乙酯为底物，以Ca(OAc)2为产物螯合剂(用于解除产物抑制剂)，以水或缓冲液为反应介质构成pH值为6.5～8.5(优选7.0)的转化体系，20～60℃(优选30℃)、150r/min条件下进行转化反应，反应结束后，获得的转化液即为含有(3S)-2-羧乙基-3-氰基-5-甲基己酸的混合液，参照Martinez的方法(Org.ProcessRes.Dev.2008，12：392-398)即可从混合液分离纯化获得(3S)-2-羧乙基-3-氰基-5-甲基己酸。所述底物的初始浓度为0.1～1.0mol/L转化体系(优选1mol/L)，所述催化剂的用量以干菌体质量计，终浓度为2～15g/L转化体系(优选10g/L)，Ca(OAc)2终浓度为20～200mmol/L转化体系(优选150mol/L)。进一步，所述催化剂按如下方法制备：将脂肪酶的基因工程菌接种至终浓度为50μg/ml卡那霉素抗性的LB液体培养基中，37℃，150rpm培养10h，获得种子液，再以体积浓度1％接种量接种到新鲜的含有终浓度50μg/ml卡那霉素的LB液体培养基中，37℃，150rpm培养至菌体浓度OD600为0.4～0.8，加入终浓度为0.1～0.5mM的IPTG，于20～30℃诱导培养6～20h后，离心，弃上清，收集沉淀，即获得含有脂肪酶的重组细胞。所述的脂肪酶可以以工程菌全细胞形式使用，也可以是未经纯化的粗酶或者完全纯化的酶的形式使用。如果需要，还可以利用本领域已知的固定化技术将本专利技术的脂肪酶制成固定化酶或者固定化细胞。本专利技术的有益效果主要体现在：本专利技术提供了一种来源于T.dupontiiATCC16461的脂肪酶及其编码基因；该脂肪酶基因可与表达载体连接构建得到含该基因的胞内表达重组质粒，再转化至大肠杆菌菌株中，获得重组大肠杆菌。该重组大肠杆菌含有脂肪酶，可以利用重组大肠杆菌细胞为催化剂进行生物催化生产普瑞巴林关键手性中间体制备(3S)-2-羧乙基-3-氰基-5-甲基己酸。本专利技术获得的脂肪酶对2-羧乙基-3-氰基-5-甲基己酸乙酯具有极高的对映选择性，具有很好的工业应用前景。(四)附图说明图1为脂肪酶基因的RT-PCR琼脂糖凝胶电泳图本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种脂肪酶，其氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。
【技术特征摘要】
1.一种脂肪酶，其氨基酸序列如SEQIDNO：2所示。2.编码权利要求1所述脂肪酶的基因，其核苷酸序列如SEQIDNO：1所示。3.含有权利要求2所述基因的重组载体。4.含有权利要求2所述基因的基因工程菌。5.权利要求2所述基因在制备脂肪酶中的应用。6.如权利要求5所述的应用，其特征在于方法为：构建含有所述脂肪酶编码基因的重组载体，将所述重组载体转化至大肠杆菌中，获得的基因工程菌进行诱导培养，从培养液分离得到含有重组脂肪酶的菌体细胞。7.权利要求1所述脂肪酶在制备(3S)-2-羧乙基-3-氰基-5-甲基己酸中的应用。8.如权利要求7所述脂肪酶在制备(3S)-2-羧乙基-3-氰基-5-甲基己酸中的应用，其特征在于具体为：以含脂肪酶的基因工程菌经诱导培养后获得的湿菌体为催化剂，以外消旋2-羧乙基-3-氰基-5-甲基己酸乙酯为底物，以Ca(OAc)2为产物螯合剂，于pH6.5～8.5缓冲液构成的反应体系中，在20～60℃下进行反应，反应结束后，获得的转化液即为含有(3S)-2-羧乙基-3-氰基-5-甲基己酸的混合液将混合液分离纯化即获得到(3S)-2...
【专利技术属性】
技术研发人员：黎小军，
申请(专利权)人：新余学院，
类型：发明
国别省市：江西;36
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。