具有磷脂酶C活性的多肽和编码它们的多核苷酸制造技术

本发明专利技术提供了具有磷脂酶C活性的多肽和编码这些多肽的多核苷酸。还提供的是包括这些多核苷酸的核酸构建体、载体、和宿主细胞连同产生这些多肽的方法。另外，本发明专利技术提供了使用具有磷脂酶C活性的多肽来减少在油组合物中的磷脂含量的方法连同该多肽的其他相关用途。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】序列表的引用本申请包括计算机可读形式的序列表，将其通过引用结合在此。专利技术背景专利
本专利技术涉及具有磷脂酶C活性的多肽和编码这些多肽的多核苷酸。本专利技术还涉及包括这些多核苷酸的核酸构建体、载体、和宿主细胞连同产生和使用这些多肽的方法。而且，本专利技术涉及使用具有磷脂酶C活性的多肽来减少在油组合物中的磷脂含量的方法。相关领域描述若干类型的磷脂酶是已知的，根据在磷脂分子中攻击的键的位置它们的特异性不同。磷脂酶A1(PLA1)除去1-位置的脂肪酸产生游离脂肪酸和1-溶血-2-酰基磷脂。磷脂酶A2(PLA2)除去2-位置的脂肪酸产生游离脂肪酸和1-酰基-2-溶血磷脂。术语磷脂酶B(PLB)被用于具有A1活性和A2活性两者的磷脂酶。磷脂酶C(PLC)除去磷酸盐部分产生1,2-二酰基甘油和磷酸酯。磷脂酶D(PLD)产生1,2-二酰基甘油磷酸盐和碱性基团(见图1)。在消费之前，将植物油脱胶以提供中性味道和浅色的精炼的存储稳定的植物油。脱胶工艺包括从富含甘油三酯的油馏分中除去磷脂组分(胶)。在工业中最常用的工艺是水脱胶、化学/苛性精炼和物理精炼(包括酸辅助脱胶和/或酶辅助脱胶)。由于磷脂组分的乳化特性，脱胶程序导致油的损失；即甘油三酯的损失。由于降低乳化特性的磷脂的有效水解，酶法脱胶会减少油损失。有关酶法脱胶的综述参见迪杰斯特拉(Dijkstra)2010，欧洲脂质科学与技术杂志(Eur.J.LipidSci.Technol.)112，1178。磷脂酶A和/或磷脂酶C在脱胶中的使用例如被描述于克劳森(Clausen)2001，欧洲脂质科学与技术杂志，103333-340，WO2003/089620和WO2008/094847。磷脂酶A的解决方案产生溶血磷脂和游离脂肪酸，导致油损失。另一方面，磷脂酶C具有产生甘油二酯(图2)的优点，该甘油二酯将保留在油中，因此将减少损失。在植物油中有四种主要的磷脂：磷脂酰胆碱(PC)、磷脂酰乙醇胺(PE)、磷脂酸(PA)和磷脂酰肌醇(PI)。磷脂酶C酶对这些磷脂具有不同的特异性。唯一已知的可商购的磷脂酶C是对PC和PE具有特异性的范恩尼姆(Verenium)/DSM的Purifine(迪杰斯特拉(Dijkstra)，第101届AOCS年会，2010年5月10日)。WO07/059927描述了用于脱胶的热稳定的芽孢杆菌(Bacillus)PLC。WO2012/062817描述了对所有四种磷脂具有特异性的真菌PLC。附图简要说明图1示出了不同的磷脂酶裂解磷脂的位置以及在磷脂上的四个主要官能团。图2示出了磷脂与磷脂酶C反应以形成甘油二酯和磷酸酯或磷酸。专利技术概述本专利技术提供选自下组的具有磷脂酶C活性的多肽，该组由以下各项组成：a)与SEQIDNO:3的成熟多肽具有至少70％序列一致性的多肽；b)由一种多核苷酸编码的一种多肽，该多核苷酸在低严格条件下与(i)SEQIDNO:1的成熟多肽编码序列、ii)其cDNA序列、或iii)i)或ii)的全长互补体杂交；c)由与SEQIDNO:1的成熟多肽编码序列或其cDNA序列具有至少70％序列一致性的多核苷酸编码的多肽；d)SEQIDNO:3的成熟多肽的一种变体，该变体在一个或多个位置处包含取代、缺失、和/或插入；以及e)(a)、(b)、(c)或(d)的多肽的片段，该片段具有磷脂酶C活性。本专利技术的其它方面包括包含本专利技术的多肽的组合物、编码本专利技术的多肽的多核苷酸和包含这些多核苷酸的核酸构建体和表达载体、包含这些多核苷酸的重组宿主细胞、产生多肽的方法和在工艺中使用这些多肽和组合物用于磷脂的水解。最后，本专利技术提供了用于减少在油中磷脂含量的方法。定义磷脂酶C活性：术语“磷脂酶C活性”或“PLC活性”涉及从磷脂中除去磷酸酯部分以产生1,2-二酰基甘油的酶活性(见图2)。大多数PLC酶属于水解酶和磷酸二酯酶家族并大体上分类为EC3.1.4.3。磷脂酶C活性可以根据在实例5中所描述的程序或通过在“对于磷脂酶活性的测定”部分所描述的测定来确定。磷脂酶C特异性：术语“磷脂酶C特异性”涉及具有磷脂酶C活性的多肽，其中该活性对一种或多种磷脂是特异性的，四种最重要的磷脂曾经是磷脂酰胆碱(PC)、磷脂酰乙醇胺(PE)、磷脂酸(PA)和磷脂酰肌醇(PI)(见图1)。磷脂酶C特异性可以通过如实例5中所述的31P-NMR来确定。等位基因变体：术语“等位基因变体”意指占用同一染色体位点的一种基因的两个或更多个替代形式中的任一者。等位基因变异由突变天然产生，并且可以导致群体内多态性。基因突变可以是沉默的(在所编码的多肽中没有改变)或可编码具有改变的氨基酸序列的多肽。多肽的等位基因变体是由基因的等位基因变体编码的多肽。催化结构域：术语“催化结构域”意指酶的包含该酶的催化机器的区域。cDNA：术语“cDNA”意指可以通过从得自真核或原核细胞的成熟的、剪接的mRNA分子进行反转录而制备的DNA分子。cDNA缺乏可以存在于对应基因组DNA中的内含子序列。早先的初始RNA转录物本是mRNA的前体，其在呈现为成熟的剪接的mRNA之前要经一系列的步骤进行加工，包括剪接。编码序列：术语“编码序列”意指直接指定多肽的氨基酸序列的多核苷酸。编码序列的边界一般由开放阅读框架决定，该开放阅读框架从起始密码子(如ATG、GTG或TTG)开始并且以终止密码子(如TAA、TAG或TGA)结束。编码序列可以是基因组DNA、cDNA、合成DNA或其组合。对照序列：术语“控制序列”是指表达编码本专利技术的成熟多肽的多核苷酸所必需的核酸序列。每个控制序列对于编码该多肽的多核苷酸来说可以是原生的(即，来自相同基因)或外源的(即，来自不同基因)，或相对于彼此是原生的或外源的。此类控制序列包括但不限于前导子、多腺苷酸化序列、前肽序列、启动子、信号肽序列、以及转录终止子。至少，控制序列包括启动子以及转录和翻译终止信号。出于引入有利于将这些控制序列与编码多肽的多核苷酸的编码区连接的特异性限制酶切位点的目的，这些控制序列可以提供有多个接头。粗制油：术语“粗制油”是指(也称为非脱胶油)从例如植物来源的压榨油或提取油或其混合物，包括但不限于巴西莓油、杏仁油、巴巴苏油、黑加仑籽油、琉璃苣籽油、菜籽油、腰果油、蓖麻油、椰子油、芫荽油、玉米油、棉籽油、海甘蓝油、亚麻籽油、葡萄籽油、榛子油、大麻籽油、麻风树油、荷荷芭油、亚麻籽油、澳洲坚果油、芒果仁油、白池花油、芥子油、牛脚油、橄榄油、棕榈油、棕榈仁油、棕榈油精、花生油、美洲山核桃油、松子油、开心果油、罂粟籽油、菜籽油、米糠油、红花油、油茶油、芝麻油、牛油树脂、大豆油、向日葵籽油、妥尔油、山茶油、胡桃油、经由遗传修饰生物体(GMO)或传统“育种”具有改变的脂肪酸成分的各种各样的“天然”油，例如高油酸油、低亚麻酸油或低饱和油(高油酸油菜油、低亚麻酸大豆油或、高硬脂酸向日葵油)。脱胶油：术语“脱胶油”是指从油中除去不可水合的磷脂、可水合的磷脂和卵磷脂(统称为“胶”)以产生可用于食品生产和/或非食品应用(例如生物柴油)的脱胶油或脂肪产品之后获得的油。在某些实施例中，脱胶油具有少于200ppm磷的磷脂含量，例如少于150ppm磷、少于100ppm磷、少于(或少于约)50ppm磷、少于(或少本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种具有磷脂酶C活性的多肽，该多肽选自下组，该组由以下各项组成：a.与SEQ ID NO:3的成熟多肽具有至少70％序列一致性的多肽；b.由一种多核苷酸编码的一种多肽，该多核苷酸在低严格条件下与(i)SEQ ID NO:1的成熟多肽编码序列、ii)其cDNA序列、或iii)i)或ii)的全长互补体杂交；c.由与SEQ ID NO:1的成熟多肽编码序列或其cDNA序列具有至少70％序列一致性的多核苷酸编码的多肽；d.SEQ ID NO:3的成熟多肽的一种变体，该变体在一个或多个位置处包含取代、缺失、和/或插入；以及e.(a)、(b)、(c)或(d)的多肽的片段，该片段具有磷脂酶C活性。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2014.03.27 CN PCT/CN2014/0741911.一种具有磷脂酶C活性的多肽，该多肽选自下组，该组由以下各项组成：a.与SEQIDNO:3的成熟多肽具有至少70％序列一致性的多肽；b.由一种多核苷酸编码的一种多肽，该多核苷酸在低严格条件下与(i)SEQIDNO:1的成熟多肽编码序列、ii)其cDNA序列、或iii)i)或ii)的全长互补体杂交；c.由与SEQIDNO:1的成熟多肽编码序列或其cDNA序列具有至少70％序列一致性的多核苷酸编码的多肽；d.SEQIDNO:3的成熟多肽的一种变体，该变体在一个或多个位置处包含取代、缺失、和/或插入；以及e.(a)、(b)、(c)或(d)的多肽的片段，该片段具有磷脂酶C活性。2.如权利要求1所述的多肽，该多肽包括SEQIDNO:3或SEQIDNO:3的成熟多肽、或SEQIDNO:3的氨基酸20至632、或SEQIDNO:3的氨基酸37至632，或由其组成，或基本上由其组成。3.如权利要求1或2所述的多肽，其中该多肽具有针对所有以下磷脂的活性：磷脂酸(PA)、磷脂酰胆碱(PC)、磷脂酰乙醇胺(PE)和磷脂酰肌醇(PI)。4.如权利要求1至3中任一项所述的多肽，其中该片段是大于550个氨基酸的并且该片段具有磷脂酶C活性。5.一种包括如权利要求1至4中任一项所述的多肽的组合物。6.一种编码根据权利要求1至4中任一项所述的多肽...

【专利技术属性】
技术研发人员：孙天齐，李明，K·博克，A·内高，J·布拉斯克，M·L·达姆斯特里普，H·M·里欧贝克，
申请(专利权)人：诺维信公司，
类型：发明
国别省市：丹麦;DK