一种miR-26a抑制剂及其应用制造技术

本发明专利技术提供了一种miR‑26a抑制剂及其应用。所提供的miR‑26a抑制剂核酸序列为AGCCUAUCCUGGAUUACUUGAA。所提供的应用包括miR‑26a抑制剂用于促进抑癌基因PTPN13表达的应用；miR‑26a抑制剂用于制备治疗肺癌药物的应用；miR‑26a抑制剂：AGCCUAUCCUGGAUUACUUGAA与吉非替尼联合用于制备治疗肺癌药物的应用。本发明专利技术的miR‑26a抑制剂抑制肺癌中miR‑26a的表达从而间接性解除miR‑26a对抑癌基因PTPN13的抑制作用，达到抑制肺癌生长的目的；同时本发明专利技术的miR‑26a抑制剂具有吉非替尼治疗肺癌的增敏作用。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于分子生物学microRNA
，涉及一种miR-26a抑制剂及其用于制备治疗肺癌药物的应用。
技术介绍
肺癌死亡率居全世界癌症死亡之首。世界范围内，大约80-85％的病例为非小细胞肺癌(NSCLC)，非小细胞肺癌包括鳞状细胞癌(SCC)，腺癌(ADC)和大细胞癌(LCC)。尽管手术、放化疗及分子靶向治疗在临床上已经广泛应用，但是晚期非小细胞肺癌的生存期短，病死率仍旧很高。microRNA是非编码小RNA，在转录后水平调节与其相对应靶基因的表达。随着实验研究的深入，发现microRNA参与调节人类恶性肿瘤的发生发展，其中miR-26a与非小细胞肺癌生长以及EGFR-TKIs耐药的关系引起越来越多的关注。阐明miR-26a在非小细胞肺癌中的作用将有助于新药研发和个体化治疗。
技术实现思路
专利技术人研究发现，肺腺癌组织较正常癌旁组织miR-26a的表达显著升高；肺腺癌细胞系SPCA1、PC-9、H2170、SW900中miR-26a的表达较正常支气管上皮细胞BEAS-2B显著升高。PTPN13是已知的抑癌基因，miR-26a通过转录后调控抑制PTPN13的表达而发挥促进非小细胞肺癌生长的作用。研究发现PTPN13通过去磷酸化Src而抑制EGFR信号通路，PTPN13的高表达可增强肺癌细胞对EGFR-TKIs的敏感性，因此，miR-26a抑制剂不仅具有抑制肺癌生长的作用，而且可以提高耐药肺癌细胞对EGFR-TKIs的敏感性。进一步研究发现，miR-26a抑制剂通过转染试剂转染入细胞后具有抑制miR-26a表达的作用，对于miR-26a表达高的肺癌细胞，在抑制miR-26a表达后，可以抑制肺癌细胞的生长，并且增加肺癌细胞对EGFR-TKIs的敏感性。本专利技术提供了一种miR-26a抑制剂。本专利技术所提供的miR-26a抑制剂核酸序列为AGCCUAUCCUGGAUUACUUGAA。本专利技术还提供了miR-26a抑制剂：AGCCUAUCCUGGAUUACUUGAA用于促进抑癌基因PTPN13表达的应用。本专利技术同时还提供了miR-26a抑制剂：AGCCUAUCCUGGAUUACUUGAA用于制备治疗肺癌药物的应用。本专利技术进一步提供了miR-26a抑制剂：AGCCUAUCCUGGAUUACUUGAA与吉非替尼联合用于制备治疗肺癌药物的应用。本专利技术的miR-26a抑制剂抑制肺癌中miR-26a从而间接性解除miR-26a对抑癌基因PTPN13的抑制作用，达到抑制肺癌生长的目的；同时本专利技术的miR-26a抑制剂具有吉非替尼治疗肺癌的增敏作用。1.miR-26a抑制剂合成：miR-26a抑制剂是化学合成的类似miR-26a反义序列的RNA或DNA。根据本专利技术所述的miR-26a序列UUCAAGUAAUCCAGGAUAGGCUCCUAUCCUGGAUUACUUGAAUU，采用寡核苷酸生物合成技术，分别合成多个miR-26a抑制剂，通过转染试剂转染入SPCA1细胞后，采用qRT-PCR的方法检测miR-26a的表达，选择抑制效率最高的miR-26a抑制序列：AGCCUAUCCUGGAUUACUUGAA。2.miR-26a在肺腺癌组织及肺腺癌细胞系中的表达异常增高：采用qRT-PCR的方法检测了5对肺腺癌及其癌旁组织和6株非小细胞肺癌细胞系A549、SPCA1、PC-9、H2170、SW900、H520中miR-26a的表达水平(以正常肺支气管上皮细胞BEAS-2B作为对照)。结果发现，肺腺癌组织及非小细胞肺癌细胞系A549、SPCA1和SW900中miR-26a表达较BEAS-2B细胞显著升高，细胞系PC-9、H2170和H520中miR-26a表达与BEAS-2B细胞无显著差异(图1)。A549、SPCA1和SW900为EGFR-TKIs耐药细胞系，而PC-9、H2170和H520为EGFR-TKIs敏感细胞系，提示miR-26a高表达可能与肺癌EGFR-TKIs耐药有关。3.miR-26a促进肺癌细胞生长，miR-26a抑制剂增强EGFR-TKIs耐药细胞对TKIs的敏感性：MTS生长实验发现在高表达miR-26a的SPCA1细胞中加入miR-26a抑制剂可抑制细胞生长；在低表达miR-26a的PC-9细胞中加入miR-26a可促进细胞生长。进一步MTS研究发现应用miR-26a抑制剂于吉非替尼耐药的SPCA1细胞，可增强SPCA1细胞对吉非替尼的敏感性；而将miR-26amimics应用于吉非替尼敏感的PC-9细胞中，可减弱PC-9细胞对吉非替尼的敏感性(图2、3)。4.miR-26a抑制PTPN13的表达：生物信息学预测发现PTPN133’UTR有miR-26a的调控序列。在PTPN13低表达的SPCA1细胞中，miR-26a抑制剂可促进SPCA1细胞PTPN13的mRNA表达和蛋白表达。在PTPN13高表达的PC-9细胞中，miR-26amimics可抑制PC-9细胞PTPN13的蛋白表达。构建包含PTPN133’UTR的质粒，将miR-26amimics与该质粒共转染于HEK293细胞中，荧光素酶基因实验证实miR-26a可以抑制PTPN13的表达PTPN133’UTR突变的质粒则无相应改变(图4)。5.PTPN13靶向p-Src使其脱磷酸化。miR-26a靶向PTPN13，而PTPN13必须调控EGFR信号通路才能发挥TKIs增敏的作用。免疫共沉淀研究发现EGFR信号通路中的Src可与PTPN13结合。PTPN13是磷脂酶，与Src结合可发挥磷脂酶去磷酸化的作用。生物信息学计算发现PTPN13-SrcpTyr416复合物的时间空间稳定性良好，并且PTPN13-Src复合物的结合位点正是PTPN13的催化域和Src的pTyr416位点。在H520细胞中基因沉默PTPN13后SrcpTyr416的磷酸化水平显著提高(图5)。6.miR-26aantagomir联合吉非替尼可使SPCA1细胞的肺移植瘤体积、重量明显缩小(图6)。移植瘤小鼠分4组：对照组，吉非替尼组，miR-26aantagomir瘤内注射组和吉非替尼灌胃联合miR-26aantagomir瘤内注射组。miR-26a抑制剂联合吉非替尼组肿瘤体积和重量缩小最明显。附图说明图1.miR-26a在肺癌组织与细胞系中的表达差异；A.qRT-PCR法检测5对非小细胞肺癌及其癌旁正常组织中miR-26a的表达水平；B.qRT-PCR法检测本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种miR‑26a抑制剂，该miR‑26a抑制剂核酸序列为AGCCUAUCCUGGAUUACUUGAA。

【技术特征摘要】
1.一种miR-26a抑制剂，该miR-26a抑制剂核酸序列为
AGCCUAUCCUGGAUUACUUGAA。
2.权利要求1所述miR-26a抑制剂用于促进抑癌基因PTPN13...

【专利技术属性】
技术研发人员：李圣青，许淑娣，杨志伟，王涛，贾林涛，张胜利，
申请(专利权)人：中国人民解放军第四军医大学，
类型：发明
国别省市：陕西;61