一种联产琥珀酸和异戊二烯的基因工程菌及其构建方法技术

本发明专利技术公开了一种联产琥珀酸和异戊二烯的基因工程菌及其构建方法，属于基因工程技术领域。本发明专利技术所提供的基因工程菌是在大肠杆菌中同时过表达异戊二烯合成途径所需酶的基因和丙酮酸羧化酶基因。同时本发明专利技术还提供了该基因工程菌的构建和使用方法。本发明专利技术所提供的基因工程菌具有联产异戊二烯和琥珀酸的能力，解决了异戊二烯生物合成过程中碳损失的问题，提高了原子经济性，同时，降低了二氧化碳的排放，具有较高的环境效益。

Gene engineering bacteria for CO production of succinic acid and isoprene and construction method thereof

The invention discloses a gene engineering bacterium for CO production of succinic acid and isoprene and a construction method thereof, belonging to the field of gene engineering technology. The gene engineering bacterium provided by the invention is a gene that expresses the required enzymes and pyruvate carboxylase genes in the synthesis pathway of Escherichia coli simultaneously. The invention also provides the construction and the use method of the gene engineering bacterium. The ability of genetic engineering bacteria of the present invention has the production of isoprene and succinic acid, solve the loss of carbon isoprenoid biosynthesis process, improve the atom economy. At the same time, reduce the emissions of carbon dioxide, with higher environmental benefits.

【技术实现步骤摘要】
一种联产琥珀酸和异戊二烯的基因工程菌及其构建方法
本专利技术涉及一种联产琥珀酸和异戊二烯的基因工程菌及其构建方法，属于基因工程

技术介绍
异戊二烯是一种重要的化工平台化合物，其95％用于合成橡胶；也是丁基橡胶的第二单体。此外，还可广泛应用于农药、医药、香料及粘结剂等领域。目前，异戊二烯的来源主要是通过石油基原料异戊烷、异戊烯脱氢法、化学合成法(包括异丁烯-甲醛法、乙炔-丙酮法、丙烯二聚法)和裂解C5馏分萃取蒸馏法。然而，随着化石资源的日益枯竭，原料来源是利用石油基原料制备异戊二烯的重要瓶颈问题。以可再生的生物质为原料，利用生物转化技术合成异戊二烯，因具有可持续性、环境友好、品质优异等优势，已成为国际上的研究热点。目前，生物基异戊二烯的生物合成路线主要是以葡萄糖为原料，利用甲羟戊酸(MVA)或甲基赤藓糖-5-磷酸(MEP)途径合成异戊二烯(JianmingYang,2012)。然而，不管是哪条合成路线，都会在合成异戊二烯的同时，产生二氧化碳，这样会造成碳转化率的损失，造成原料葡萄糖的浪费，增加合成成本，限制了该技术的发展和应用。此外，已有异戊二烯生物合成的报道多数是有氧发酵，由于异戊二烯与氧气混合，能形成爆炸性混合物，使其生物合成存在安全风险。琥珀酸可用于食品添加剂，药物添加剂，去污剂添加物，发泡剂，离子螯合剂。目前，国际市场上工业用琥珀酸的年需求量超过15,000吨，售价在$5.90～8.80/kg(因纯度而异)，市场潜力较大。目前，许多的化工产品都是以苯为原料的，但苯是石油化工产品，不具有可再生性。从长远考虑必须找到合适的可再生原料取代苯。利用生物技术，发酵合成琥珀酸是近年来得研究热点。葡萄糖经糖酵解途径生产磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)和丙酮酸。PEP经羧化生成草酰乙酸，继而还原生成琥珀酸及延胡索酸，最后再经一步还原生成琥珀酸。常规利用代谢工程方法改造大肠杆菌以生产琥珀酸的方法是通过失活丙酮酸-甲酸裂解酶和乳酸脱氢酶以消除包括甲酸、乙酸、乙醇和乳酸等竞争途径。Millard等人通过在大肠杆菌JCL1208中过量表达PEP羧化酶，可以使琥珀酸产量提高3.5倍，但过量表达PEP激酶却没有任何效果。在琥珀酸合成过程中，不管是利用PEP还是用丙酮酸合成，都需要利用一分子的二氧化碳。如果能联产异戊二烯和琥珀酸，使合成异戊二烯过程中释放的二氧化碳用于合成琥珀酸，就可避免碳原子的浪费。此外，在厌氧条件下，由于不存在外源电子受体，要以中间产物为电子受体二自身得以氧化，要保证细胞内氧化还原平衡。即现有方法中碳原子利用最大化与氧化还原平衡之间存在矛盾，若要满足氧化还原平衡，底物中一半的碳原子会以PEP或(和)草酰乙酸的形式积累；若要满足碳最大化的流向目标产物，又需要额外添加NADH。然而，基于细胞代谢的复杂性，通过基因工程技术实现将异戊二烯合成过程中产生的二氧化碳用于琥珀酸的合成存在很大的不可预知性和不确定性，因此，目前尚没有联产异戊二烯和琥珀酸的报道。
技术实现思路
为解决上述问题，本专利技术提供了一种联产琥珀酸和异戊二烯的基因工程菌及其构建方法，所采取的技术方案如下：本专利技术的一个目的在于提供一种联产琥珀酸和异戊二烯的基因工程菌。该基因工程菌是在大肠杆菌中同时过表达异戊二烯合成途径所需酶的基因和丙酮酸羧化酶基因。优选地，所述异戊二烯合成途径，是异戊二烯MVA合成途径或MEP合成途径。优选地，所述基因工程菌是在大肠杆菌中共表达乙酰辅酶A酰基转移酶/羟甲基戊二酰辅酶A还原酶基因、3-羟-3-甲基戊二酰辅酶A合酶基因、甲羟戊酸激酶基因、甲羟戊酸-5-磷酸激酶基因、甲羟戊酸-5-二磷酸脱羧酶基因、异戊烯焦磷酸异构酶基因、异戊二烯合成酶基因和丙酮酸羧化酶基因。更优选地，所述乙酰辅酶A酰基转移酶/羟甲基戊二酰辅酶A还原酶基因、3-羟-3-甲基戊二酰辅酶A合酶基因和异戊二烯合成酶基因连接于pACYCDuet-1质粒的多克隆位点上；所述甲羟戊酸激酶基因、甲羟戊酸-5-磷酸激酶基因、甲羟戊酸-5-二磷酸脱羧酶基因和异戊烯焦磷酸异构酶基因连接于pTrc质粒的多克隆位点上；所述丙酮酸羧化酶基因连接于pCOLADuet-1质粒上。优选地，所述大肠杆菌，共表达1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸合成酶基因、5-磷酸脱氧木酮糖还原异构酶基因、异戊二烯合成酶基因和丙酮酸羧化酶基因。更优选地，所述1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸合成酶基因、5-磷酸脱氧木酮糖还原异构酶基因和异戊二烯合成酶基因连接于pACYDuet-1质粒的多克隆表达位点上；所述丙酮酸羧化酶基因连接于pCOLADuet-1质粒上。本专利技术的另一目的是提供一种所述基因工程菌的构建方法，该方法的步骤如下：1)将乙酰辅酶A酰基转移酶基因/羟甲基戊二酰辅酶A还原酶基因mvaE、3-羟-3-甲基戊二酰辅酶A合酶基因mvaS以及异戊二烯合成酶基因isps4克隆到质粒pACYCDuet-1，构建重组质粒pACY-mvaE-mvaS-isps4；2)将甲羟戊酸激酶基因ERG12、甲羟戊酸-5-磷酸激酶基因ERG8、甲羟戊酸-5-二磷酸脱羧酶基因ERG19以及异戊烯焦磷酸异构酶基因IDI1克隆到pTrcHis2B，得到重组质粒pTrc-low；3)将丙酮酸羧化酶基因pyc克隆到质粒pCOLADUet-1上，得到重组质粒pCOLA-PYC；4)将步骤1)，2)和3)所得的重组质粒转化到大肠杆菌宿主细胞中，获得基因工程菌。本专利技术还提供了另一种所述基因工程菌的构建方法，该方法的步骤如下：1)将丙酮酸羧化酶基因pyc克隆到质粒pCOLADUet-1上，得到重组质粒pCOLA-PYC；2)将1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸合成酶基因dxs、5-磷酸脱氧木酮糖还原异构酶基因dxr和异戊二烯合成酶基因isps4克隆到质粒pACYCDuet-1，构建重组质粒pACY-dxs-dxr-isps4；3)将步骤1)和步骤2)所制备的重组质粒转化到大肠杆菌宿主细胞中，获得基因工程菌。所述任一基因工程菌在发酵生产异戊二烯和琥珀酸中的应用也在本专利技术的保护范围之内。所述应用的步骤如下：1)将权利要求1所述基因工程菌接种到M9种子培养基中，在37℃、180rpm活化培养18-24h，获得种子菌液；2)将步骤1)所得的种子菌液以10％的接种量接种到发酵培养基中，在转速300-800rpm，37℃的条件下培养至OD600为20-40，再添加总浓度为0.1-1.0mM的IPTG，关闭空气，通过氮气或二氧化碳，并利用氨水或碳酸钾控制pH在7.0，在厌氧25-37℃的条件下诱导表达。本专利技术所涉及的各种基因中，所述乙酰辅酶A酰基转移酶基因/羟甲基戊二酰辅酶A还原酶基因、3-羟-3-甲基戊二酰辅酶A合酶基因优选来源于粪肠球菌(Enterococcusfaecalis)；所述甲羟戊酸激酶基因、甲羟戊酸-5-磷酸激酶基因、甲羟戊酸-5-二磷酸脱羧酶基因、异戊烯焦磷酸异构酶基因优选来源于酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)。所述异戊二烯合成酶基因来源于银白杨(Populusalba)；所述丙酮酸羧化酶基因，优选来源于枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)；所述1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸合成酶基因、5-磷酸脱氧木本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种联产琥珀酸和异戊二烯的基因工程菌，其特征在于，在大肠杆菌中同时过表达异戊二烯合成途径所需酶的基因和丙酮酸羧化酶基因。

【技术特征摘要】
1.一种联产琥珀酸和异戊二烯的基因工程菌，其特征在于，在大肠杆菌中同时过表达异戊二烯合成途径所需酶的基因和丙酮酸羧化酶基因。2.根据权利要求1所述一种联产琥珀酸和异戊二烯的基因工程菌，其特征在于，所述异戊二烯合成途径，是指异戊二烯MVA合成途径或MEP合成途径。3.根据权利要求1所述一种联产琥珀酸和异戊二烯的基因工程菌，其特征在于，是在大肠杆菌中共表达乙酰辅酶A酰基转移酶/羟甲基戊二酰辅酶A还原酶基因、3-羟-3-甲基戊二酰辅酶A合酶基因、甲羟戊酸激酶基因、甲羟戊酸-5-磷酸激酶基因、甲羟戊酸-5-二磷酸脱羧酶基因、异戊烯焦磷酸异构酶基因、异戊二烯合成酶基因和丙酮酸羧化酶基因。4.根据权利要求3所述基因工程菌，其特征在于，所述乙酰辅酶A酰基转移酶/羟甲基戊二酰辅酶A还原酶基因、3-羟-3-甲基戊二酰辅酶A合酶基因和异戊二烯合成酶基因连接于pACYCDuet-1质粒的多克隆位点上；所述甲羟戊酸激酶基因、甲羟戊酸-5-磷酸激酶基因、甲羟戊酸-5-二磷酸脱羧酶基因和异戊烯焦磷酸异构酶基因连接于pTrc质粒的多克隆位点上；所述丙酮酸羧化酶基因连接于pCOLADuet-1质粒上。5.根据权利要求1所述一种联产琥珀酸和异戊二烯的基因工程菌，其特征在于，所述大肠杆菌，共表达1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸合成酶基因、5-磷酸脱氧木酮糖还原异构酶基因、异戊二烯合成酶基因和丙酮酸羧化酶基因。6.根据权利要求5所述基因工程菌，其特征在于，所述1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸合成酶基因、5-磷酸脱氧木酮糖还原异构酶基因和异戊二烯合成酶基因连接于pACYDuet-1质粒的多克隆表达位点上；所述丙酮酸羧化酶基因连接于pCOLADuet-1质粒上。7.一种权利要求1所述基因工程菌的构建方法，其特征在于，步骤如下：1)将乙酰辅酶A酰基转移酶基因/羟甲基...

【专利技术属性】
技术研发人员：咸漠，刘炜，刘会洲，
申请(专利权)人：中国科学院青岛生物能源与过程研究所，
类型：发明
国别省市：山东,37