高产吩嗪‑1‑甲酰胺的基因工程菌株及其构建方法技术

本发明专利技术公开了一株高产吩嗪‑1‑甲酰胺的基因工程菌株及其构建方法；所述基因工程菌株具体是敲除绿针假单胞菌(Pseudomonas chlororaphis)HT66CCTCC NO:M 2013467基因组的lon基因、parS基因中的一个或两个基因而得到基因工程菌株；或者，敲除绿针假单胞菌(Pseudomonas chlororaphis)HT66CCTCC NO:M 2013467rpeA、psrA单突变株或者双突变株基因组的lon基因、parS基因中的一个或两个基因而得到基因工程菌株；其中，所述单突变株为HT66ΔrpeA、HT66ΔpsrA，双突变株为HT66ΔrpeAΔpsrA。与现有技术相比，本发明专利技术从一株绿针假单胞菌出发，将该菌基因组中lon和parS基因删除后，吩嗪‑1‑甲酰胺的发酵产量高达2425mg/L，可以用于吩嗪‑1‑甲酰胺的工业化生产与农业应用。

Gene engineering strains with high yield of phenazine 1 formamide and its construction method

Gene engineering strain of the invention discloses a high-yield phenazine 1 formamide and construction method thereof; the gene engineering strain specific knockdown of Pseudomonas chloroaphis (Pseudomonas chlororaphis) one or two genes HT66CCTCC NO:M 2013467 genome lon gene, parS gene and gene engineering strain; or knockout of Pseudomonas chloroaphis (Pseudomonas chlororaphis) HT66CCTCC 2013467rpeA, psrA NO:M single mutations in a gene or two strains or double mutant genome lon gene, parS gene and get the gene engineering strain; among them, the single mutant of HT66 rpeA HT66 psrA, double mutant HT66 Delta rpeA Delta psrA. Compared with the prior art, the invention starting from a strain of Pseudomonas chloroaphis, remove lon and parS gene in genome of the bacteria after fermentation yield of phenazine 1 formamide is up to 2425mg/L, can be used in industrial production and agricultural application of phenazine 1 formamide.

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于基因工程领域，涉及假单胞菌基因工程菌株及其构建方法，尤其是一株高产吩嗪-1-甲酰胺的基因工程菌株及其构建方法。
技术介绍
我国常见的农作物病害生物达1600种，每年造成的损失约为1000亿人民币，严重地影响了我国农业的发展。近些年，化学农药的大规模使用导致了病虫害的抗药性不断增强。此外，高浓度和毒性的化学农药的应用，对农田、水环境也造成了很大的污染，严重威胁着我国的粮食安全和生命健康。因此，低毒性、低残留和不易产生抗药性的生物农药获得了各国政府和农药企业的极大关注。与化学农药相比，生物农药具有毒性低、对环境友好和不易产生抗药性等明显优势，已经吸引了越来越多学者的关注并逐渐应用到生物防治实践当中。其中，上海交通大学彭华松课题组率先利用铜绿假单胞菌株M18开发出了具有广谱、高效、安全和能有效控制真菌性根腐和茎腐的生物农药吩嗪-1-羧酸(phenazine-1-carboxylicacid，简称PCA，CAS号为2538-68-3)，定名为“申嗪霉素”，主要用于防治水稻纹枯病、小麦赤霉病、黄瓜和西瓜的枯萎病、甜瓜蔓枯病、辣椒根腐病等，并获得了农业部颁发的新农药药证。但最近相关研究发现，与PCA相比，另一种吩嗪类抗生素吩嗪-1-甲酰胺(phenazine-1-carboxamide，PCN)具有更好的安全性、稳定性及对植物病原菌的抑菌活性，在防治水稻纹枯病和小麦赤霉病等方面具有重要的应用价值。据报道，目前能合成PCN的微生物菌株有绿针假单胞菌PCL1391，铜绿假单胞菌PAO1，PUPa3，PUP6，MML221等，但由于PCN产率较低，尚未能大规模推广应用。上海交通大学彭华松课题组对筛选的一株绿针假单胞菌HT66进行基因工程改造后，PCN的产量已经达到1800mg/L并申报了中国专利技术专利(CN201310566864.5)，但是该产量距离PCN的工业化应用还存在一定的距离。因此，通过基因工程技术进一步改造该菌株将有利于提高PCN产量，实现其农业应用。
技术实现思路
针对现有技术中的缺陷，本专利技术的目的是提供一株高产吩嗪-1-甲酰胺的基因工程菌株及其构建方法，克服现有菌株生产吩嗪-1-甲酰胺产量和效率较低的缺陷，提供一种用于生产吩嗪-1-甲酰胺的基因工程菌株及其用途。本专利技术的目的是通过以下技术方案来实现的：第一方面，本专利技术涉及一株高产吩嗪-1-甲酰胺的基因工程菌株，具体是敲除绿针假单胞菌(Pseudomonaschlororaphis)HT66CCTCCNO:M2013467基因组的lon基因、parS基因中的一个或两个基因而得到基因工程菌株；或者，敲除绿针假单胞菌(Pseudomonaschlororaphis)HT66CCTCCNO:M2013467rpeA、psrA单突变株或者双突变株基因组的lon基因、parS基因中的一个或两个基因而得到基因工程菌株；其中，所述单突变株为HT66ΔrpeA、HT66ΔpsrA，双突变株为HT66ΔrpeAΔpsrA。优选地，所述lon基因的碱基序列如SEQIDNO.1所示；所述parS基因的碱基序列如SEQIDNO.2所示。优选地，所述基因工程菌株为HT66Δlon、HT66ΔparS、HT66ΔlonΔparS、HT66ΔlonΔrpeA、HT66ΔparSΔrpeA、HT66ΔlonΔparSΔrpeA、HT66ΔlonΔpsrA、HT66ΔpsrAΔparS、HT66ΔlonΔparSΔpsrA、HT66ΔlonΔparSΔpsrAΔrpeA、HT66ΔlonΔpsrAΔrpeA、HT66ΔparSΔpsrAΔrpeA。其中，所述基因工程菌株HT66Δlon是敲除绿针假单胞菌(Pseudomonaschlororaphis)HT66CCTCCNO:M2013467基因组的lon基因而得到基因工程菌株；所述基因工程菌株HT66ΔparS是敲除绿针假单胞菌(Pseudomonaschlororaphis)HT66CCTCCNO:M2013467基因组的parS基因而得到基因工程菌株；所述基因工程菌株HT66ΔlonΔparS是敲除绿针假单胞菌(Pseudomonaschlororaphis)HT66CCTCCNO:M2013467基因组的lon基因、parS基因而得到基因工程菌株。更优选地，所述基因工程菌株为HT66ΔlonΔparS、HT66ΔlonΔrpeA、HT66ΔparSΔrpeA、HT66ΔlonΔparSΔrpeA、HT66ΔlonΔpsrA、HT66ΔlonΔparSΔpsrA、HT66ΔlonΔparSΔpsrAΔrpeA、HT66ΔlonΔpsrAΔrpeA。第二方面，本专利技术还涉及所述高产吩嗪-1-甲酰胺的基因工程菌株的构建方法，具体是：敲除绿针假单胞菌(Pseudomonaschlororaphis)HT66CCTCCNO:M2013467基因组的lon基因、parS基因中的一个基因或两个基因，即可；或者，敲除绿针假单胞菌(Pseudomonaschlororaphis)HT66CCTCCNO:M2013467rpeA、psrA单突变株或者双突变株基因组的lon基因、parS基因中的一个或两个基因而得到基因工程菌株；其中，所述单突变株为HT66ΔrpeA、HT66ΔpsrA，双突变株为HT66ΔrpeAΔpsrA。优选地，所述lon基因的碱基序列如SEQIDNO.1所示；所述parS基因的碱基序列如SEQIDNO.2所示。优选地，所述构建方法中，敲除绿针假单胞菌(Pseudomonaschlororaphis)HT66CCTCCNO:M2013467基因组的lon基因、parS基因中的一个基因的步骤具体包括：i、扩增lon基因或parS基因片段的上下游同源臂；ii、采用融合PCR法连接上下游同源臂并插入pK18mobsacB质粒中得lon基因或parS基因重组质粒；iii、(a)使lon基因重组质粒上的lon基因上下游同源臂片段与HT66、HT66ΔparS、HT66ΔrpeA、HT66ΔrpeAΔparS、HT66ΔpsrA、HT66ΔpsrAΔparS、HT66ΔrpeAΔpsrA、HT66ΔrpeAΔpsrAΔparS基因组中的lon基因发生同源重组；或(b)使parS基因重组质粒上的parS基因上下游同源臂片段与HT66、HT66Δlon、HT66ΔrpeA、HT66ΔrpeAΔlon、HT66ΔpsrA、HT66ΔpsrAΔlon、HT66ΔrpeAΔpsrA、HT66ΔrpeAΔpsrAΔlon基因组中的parS基因发生同源重组；筛选阳性克隆，即得。上述敲除中，所述pK18mobsacB质粒为假单胞菌和大肠杆菌的穿梭质粒。第三方面，本专利技术提供一种基于所述基因工程菌株的吩嗪-1-甲酰胺合成方法，具体包括如下步骤：将所述基因工程菌株的种子发酵液接种于KB发酵培养基中，培养，即可。优选地，所述种子发酵液的制备具体为：将所述基因工程菌株接种于KB培养基中，置于28℃、180转/分下培养至OD600为0.5～2.0，即得。优选地，所述培养的条件具体为：24～30℃、100～300转/分钟、24～72h。优选地，所述种本文档来自技高网...

【技术保护点】
一株高产吩嗪‑1‑甲酰胺的基因工程菌株，其特征在于，具体是敲除绿针假单胞菌(Pseudomonas chlororaphis)HT66CCTCC NO:M 2013467基因组的lon基因、parS基因中的一个或两个基因而得到基因工程菌株；或者，敲除绿针假单胞菌(Pseudomonas chlororaphis)HT66CCTCC NO:M 2013467rpeA、psrA单突变株或者双突变株基因组的lon基因、parS基因中的一个或两个基因而得到基因工程菌株；其中，所述单突变株为HT66ΔrpeA、HT66ΔpsrA，双突变株为HT66ΔrpeAΔpsrA。

【技术特征摘要】
1.一株高产吩嗪-1-甲酰胺的基因工程菌株，其特征在于，具体是敲除绿针假单胞菌(Pseudomonaschlororaphis)HT66CCTCCNO:M2013467基因组的lon基因、parS基因中的一个或两个基因而得到基因工程菌株；或者，敲除绿针假单胞菌(Pseudomonaschlororaphis)HT66CCTCCNO:M2013467rpeA、psrA单突变株或者双突变株基因组的lon基因、parS基因中的一个或两个基因而得到基因工程菌株；其中，所述单突变株为HT66ΔrpeA、HT66ΔpsrA，双突变株为HT66ΔrpeAΔpsrA。2.根据权利要求1所述的高产吩嗪-1-甲酰胺的基因工程菌株，其特征在于，所述lon基因的碱基序列如SEQIDNO.1所示；所述parS基因的碱基序列如SEQIDNO.2所示。3.根据权利要求1所述的高产吩嗪-1-甲酰胺的基因工程菌株，其特征在于，所述基因工程菌株包括HT66Δlon、HT66ΔparS、HT66ΔlonΔparS、HT66ΔlonΔrpeA、HT66ΔparSΔrpeA、HT66ΔlonΔpsrA、HT66ΔpsrAΔparS、HT66ΔlonΔparSΔrpeA、HT66ΔlonΔparSΔpsrA、HT66ΔlonΔpsrAΔrpeA、HT66ΔparSΔpsrAΔrpeA、HT66ΔlonΔparSΔpsrAΔrpeA。4.根据权利要求3所述的高产吩嗪-1-甲酰胺的基因工程菌株，其特征在于，所述基因工程菌株为HT66ΔlonΔparS、HT66ΔlonΔrpeA、HT66ΔparSΔrpeA、HT66ΔlonΔparSΔrpeA、HT66ΔlonΔpsrA、HT66ΔlonΔparSΔpsrA、HT66ΔlonΔparSΔpsrAΔrpeA、HT66ΔlonΔpsrAΔrpeA。5.一种根据权利要求1所述高产吩嗪-1-甲酰胺的基因工程菌株的构建方法，其特征在于，具体是：敲除绿针假单胞菌(Pseudomonaschlororaphis)HT66CCTCCNO:M2013467基因组的lon基因、parS基因中的一个基因或两个基因，即可；或者，敲除绿针...

【专利技术属性】
技术研发人员：彭华松，张雪洪，谭剑，
申请(专利权)人：上海交通大学，
类型：发明
国别省市：上海;31