一种土霉素降解菌株的筛选方法技术

本发明专利技术涉及一种土霉素降解菌株的筛选方法，属于微生物降解抗生素残留技术领域。具体为：菌株分离；菌株降解功能验证；土霉素降解菌株的分离；菌株降解活性测定。本发明专利技术采用的筛选方法快速易行，经济廉价，有利于同时获得降解不同浓度土霉素残留的菌株，特别是降解低浓度或频营养级土霉素的高效菌株。所得到的菌株可用于制备土霉素降解菌剂；本发明专利技术利用土霉素菌肥为筛选的最初原料，所得到的菌株及制成的菌剂可直接用于土霉素企业废弃物的处理，也有可能应用于周边被土霉素污染的土壤与水体环境的修复；本发明专利技术用高效液相色谱法测定菌株降解活性，所得结果的准确度和精度较高。

Screening method for oxytetracycline degrading bacteria

The invention relates to a screening method for oxytetracycline degrading bacteria, belonging to the technical field of microbial degradation of antibiotic residues. Specifically, isolation of strains, degradation of bacteria, functional verification, isolation of oxytetracycline degrading strains and determination of degrading activity of strains. The screening method used by the invention is quick and easy, economical and cheap, and is favorable for simultaneously obtaining strains for degrading oxytetracycline residues at different concentrations, in particular degrading high-efficiency strains of low concentration or frequency nutrition grade oxytetracycline. The resulting strain can be used for the preparation of oxytetracycline degrading bacteria; the invention uses for the initial screening of oxytetracycline fertilizer raw materials, and the resulting strain and made of bacteria can be directly used for processing enterprises of oxytetracycline waste, may also be used to repair the soil and water environment pollution in the surrounding oxytetracycline; the present invention by HPLC method for the determination of degradation activity, the results of accuracy and precision.

【技术实现步骤摘要】
一种土霉素降解菌株的筛选方法
本专利技术涉及一种土霉素降解菌株的筛选方法，属于微生物降解抗生素残留

技术介绍
土霉素(Oxytetracycline)，又称地霉素，氧四环素，属于四环素类抗生素。化学名称为：(4s,4аR，5S，5аR，6S，12аS)-N-4-二甲胺基-1，4，4а，5，5а，6，11，12а-八氢，5,6，10，12，12а-六羟基-6-甲基-1，11-二氧代并四苯-2-甲酰胺，分子式：C22H24N2O9，相对分子质量：460.58，化学结构式为：土霉素为广谱抗生素，许多立克次体属、支原体属、衣原体属、螺旋体、阿米巴原虫和某些疟原虫对其敏感。其他如放线菌属、炭疽杆菌、单核细胞增多性李斯特菌、梭状芽孢杆菌、奴卡菌属、弧菌、布鲁菌属、弯曲杆菌、耶尔森菌等也对其敏感。目前，土霉素环境残留问题已经成为国内外普遍关注的热点环境问题之一。至今，国内外有关土霉素生物降解与降解菌株筛选方面的研究报道也不是很多。显然，研究并提出一种快速、高效、并能同时获得降解不同浓度土霉素菌株的筛选方法，特别是降解低浓度或贫营养级土霉素的高效菌株，以获得最大程度地降解效果，在抗生素生物降解理论与方法的研究上具有重要的科学意义与应用前景。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种快速、高效、并能同时获得降解不同浓度土霉素菌株的筛选方法。一种土霉素降解菌株的筛选方法，包括以下过程：1)土霉素降解菌株的分离采集土霉素菌肥，然后将菌肥加入到蒸馏水中，混合均匀，提取菌肥浸出液；菌肥和蒸馏水的添加比例为1g：10ml；分别吸取100ul菌肥浸出液，涂布于土霉素含量不同的无机盐固体培养基上，置于30℃条件下遮光培养2天，得到菌落；培养基中土霉素含量为25mg/l-100mg/l；2)菌株纯化将步骤1)分离得到的菌落，在含有土霉素的无机盐固体培养基平板划线，进一步分离和纯化；此步骤可重复2-3次，直至得到单一菌落；然后将单菌落接入含有土霉素的无机盐液体培养基中，置于30℃，150r/min震荡条件下，遮光培养2天，得到单一菌落培养液；3)菌株降解功能验证将步骤2)得到的培养液，在土霉素为唯一碳源且土霉素浓度不同的无机盐固体培养基平板上划线，30℃遮光培养2天；能够生长的菌株即为能够以土霉素为唯一碳源的降解菌株；通过观察可以得到菌株能够利用和降解土霉素的浓度范围；4)菌株降解活性验证将步骤3)得到的能够以土霉素为唯一碳源生长的菌株，接到活化培养基上进行活化；然后将活化的菌液按1％的接种量，转接到以土霉素为唯一碳源且浓度适宜的无机盐液体培养基中，30℃，150r/min震荡暗培养培养2天，最后用高效液相色谱法测定菌株对土霉素的降解率；试管斜面保存不同浓度降解率高的菌株，4℃储存。以上各个步骤所用到的培养基为：步骤1)中无机盐固体培养基的组成为：氯化铵1g，磷酸二氢钾0.5g，磷酸氢二钾1.5g，硫酸镁0.2g，氯化钠1g，琼脂20g，蒸馏水1000ml，调节pH至7.0，高压灭菌；在倒平板前，在培养基中添加土霉素，添加浓度依次为25、50、100mg/l，摇匀。步骤2)中无机盐固体培养基的组成为：氯化铵1g，磷酸二氢钾0.5g，磷酸氢二钾1.5g，硫酸镁0.2g，氯化钠1g，琼脂20g，蒸馏水1000ml，调节pH至7.0，高压灭菌；在倒平板前，在培养基中添加土霉素，添加浓度依次为25mg/l，摇匀。步骤2)中无机盐液体培养基的组成为：氯化铵1g，磷酸二氢钾0.5g，磷酸氢二钾1.5g，硫酸镁0.2g，氯化钠1g，蒸馏水1000ml，调节pH至7.0，高压灭菌；在冷却到室温后，在培养基中添加土霉素，添加浓度为25mg/l，摇匀。步骤3)中无机盐固体培养基的组成为：氯化铵1g，磷酸二氢钾0.5g，磷酸氢二钾1.5g，硫酸镁0.2g，氯化钠1g，琼脂20g，蒸馏水1000ml，调节pH至7.0，高压灭菌；在倒平板前，在培养基中添加土霉素，添加浓度依次为50mg/l、100mg/l，摇匀。步骤4)中细菌活化培养基为牛肉膏蛋白胨培养基，其配方为：牛肉膏3g，蛋白胨5g。氯化钠5g，琼脂18g，蒸馏水定容至1000ml，用1mol/l氢氧化钠调节pH至7.0-7.2后灭菌。其中，步骤1)和步骤2)包括以下过程：a)菌种富集采集菌肥，称取菌肥10g，加至装有100ml灭菌蒸馏水的三角瓶中(250ml，内含玻璃珠)，在恒温摇床上以30℃，200r/min震荡30min，取出后静置；吸取1ml菌肥浸出液，装入100ml富集培养基的500ml的三角瓶中，30℃,150r/min震荡条件下，暗培养2天；然后取10ml培养液转入新的相同的培养基中，在相同的条件下继续富集培养一次；无机盐液体富集培养基组成为：氯化铵1g，磷酸二氢钾0.5g，磷酸氢二钾1.5g，硫酸镁0.2g，氯化钠1g，琼脂20g，蒸馏水1000ml，调节pH至7.0，分装到250ml三角瓶中，高压灭菌，在超净工作台中添加土霉素，添加浓度依次为25、50、100mg/l，摇匀；b)菌株分离吸取100ul上述富集培养液，分别一一对应涂布于上面所述3种不同土霉素浓度的无机盐固体培养基平板上，置于30℃条件下遮光培养2天；无机盐固体培养基的组成为：氯化铵1g，磷酸二氢钾0.5g，磷酸氢二钾1.5g，硫酸镁0.2g，氯化钠1g，琼脂20g，蒸馏水1000ml，调节pH至7.0，高压灭菌；在倒平板前，在培养基中添加土霉素，添加浓度与无机盐液体富集培养基相同。该土霉素降解菌即假单胞菌属(Pseudomonassp.)，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，邮编100101，保藏编号为CGMCCNo13051，保藏日期为2016年9月28。附件提供保藏证明文件。本专利技术采用一种土霉素降解菌株的筛选方法，筛选方法快速易行，经济廉价，所得到的菌株可用于制备土霉素菌剂菌剂；本专利技术利用土霉素菌肥为筛选的最初原料，所得到的菌株及制成的菌剂可直接应用于土霉素企业废弃物的处理，也有可能应用于周边被土霉素污染的土壤与水体环境的修复；本专利技术采用高效液相色谱法测定菌株降解活性，所得结果的准确度和精度较高。附图说明图1为土霉素标准溶液高效液相色谱图；图2为土霉素高效液相色谱标准曲线图；图3为土霉素降解菌株降解效率测定图。具体实施方式结合实施例说明本专利技术的具体实施方式。实施例1菌样品采集与处理采集菌肥生产企业的菌肥，并称取菌肥10g，加至装有100ml灭菌蒸馏水的三角瓶中(250ml，内含玻璃珠)，在恒温摇床上以30℃，200r/min震荡30min，取出后静置；菌株分离吸取100ul菌肥浸出液，涂布于无机盐固体培养基平板上，置于30℃条件下遮光培养2天。无机盐固体培养基的组成为：氯化铵1g，磷酸二氢钾0.5g，磷酸氢二钾1.5g，硫酸镁0.2g，氯化钠1g，琼脂20g，蒸馏水1000ml，调节pH至7.0，高压灭菌。在倒平板前，在培养基中添加土霉素，添加浓度依次为25、50、100mg/l，摇匀。菌株纯化取平板上分离得到的单菌落，在含有土霉素的无机盐固体培养基平板划线，进一步分离和纯化；此步骤可重复2-3次，直至得到单一菌落；然后将单菌落接入含有本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种土霉素降解菌株的筛选方法，特征在于，包括以下过程：1)土霉素降解菌株的分离采集菌肥，将菌肥加入到蒸馏水中，混合，提取菌肥浸出液；吸取菌肥浸出液，涂布于土霉素含量不同的无机盐固体培养基平板上，置于30℃条件下遮光培养2天，得到菌落；2)菌株纯化将步骤1)分离得到的菌落，在含有土霉素的无机盐固体培养基平板上划线，进一步分离和纯化；此步骤重复2‑3次，直至得到单一菌落；然后将单菌落接入含有土霉素的无机盐液体培养基中，置于30℃，150r/min震荡条件下，遮光培养2天，得到单一菌落培养液；3)菌株降解功能验证将步骤2)得到的培养液，在土霉素为唯一碳源且土霉素浓度不同的无机盐固体培养基平板上划线，在30℃避光培养2天；能够生长的菌株即为能够以土霉素为唯一碳源的降解菌株；4)菌株降解活性测定将步骤3)得到的能在土霉素为唯一碳源生长的菌株，转接到细菌活化培养基上进行活化；然后将活化的菌液按1％的接种量。转接到以土霉素为唯一碳源且浓度适宜的无机盐液体培养基中，30℃，150r/min震荡培养7天，最后用高效液相色谱法测定菌株对土霉素的降解率；试管斜面保存不同浓度降解率高的菌株，4℃储存。

【技术特征摘要】
1.一种土霉素降解菌株的筛选方法，特征在于，包括以下过程：1)土霉素降解菌株的分离采集菌肥，将菌肥加入到蒸馏水中，混合，提取菌肥浸出液；吸取菌肥浸出液，涂布于土霉素含量不同的无机盐固体培养基平板上，置于30℃条件下遮光培养2天，得到菌落；2)菌株纯化将步骤1)分离得到的菌落，在含有土霉素的无机盐固体培养基平板上划线，进一步分离和纯化；此步骤重复2-3次，直至得到单一菌落；然后将单菌落接入含有土霉素的无机盐液体培养基中，置于30℃，150r/min震荡条件下，遮光培养2天，得到单一菌落培养液；3)菌株降解功能验证将步骤2)得到的培养液，在土霉素为唯一碳源且土霉素浓度不同的无机盐固体培养基平板上划线，在30℃避光培养2天；能够生长的菌株即为能够以土霉素为唯一碳源的降解菌株；4)菌株降解活性测定将步骤3)得到的能在土霉素为唯一碳源生长的菌株，转接到细菌活化培养基上进行活化；然后将活化的菌液按1％的接种量。转接到以土霉素为唯一碳源且浓度适宜的无机盐液体培养基中，30℃，150r/min震荡培养7天，最后用高效液相色谱法测定菌株对土霉素的降解率；试管斜面保存不同浓度降解率高的菌株，4℃储存。2.根据权利要求1所述的一种土霉素降解菌株的筛选方法，其特征在于：步骤1)中菌肥和蒸馏水的添加比例为1g：10ml，吸取菌肥浸出液的体积为100ul。3.根据权利要求1所述的一种土霉素降解菌株的筛选方法，其特征在于：步骤1)中中所述的无机盐固体培养基中土霉素含量为25mg/l-100mg/l。4.根据权利要求1所述的一种土霉素降解菌株的筛选方法，其特征在于：步骤1)中无机盐固体培养基的组成为：氯化铵1g，磷酸二氢钾0.5g，磷酸氢二钾1.5g，硫酸镁0.2g，氯化钠1g，琼脂20g，蒸馏水1000ml，调节pH至7.0，高压灭菌；在倒平板前，在培养基中添加土霉素，添加浓度依次为25、50、100mg/l，摇匀。5.根据权利要求1所述的一种土霉素降解菌株的筛选方法，其特征在于：步骤2)中无机盐固体培养基的组成为：氯化铵1g，磷酸二氢钾0.5g，磷酸氢二钾1.5g，硫酸镁0.2g，氯化钠1g，琼脂20g，蒸馏水1000ml，调节pH至7.0，高压灭菌；在倒平板前，在培养基中添加土霉素，添加浓度依次为25mg/l，摇匀。6.根据权利要求1所述的...

【专利技术属性】
技术研发人员：李兆君，孟应宏，冯瑶，文贻荣，文贻宣，
申请(专利权)人：中国农业科学院农业资源与农业区划研究所，湖南省中科农业有限公司，
类型：发明
国别省市：北京,11