一种表达纤维素外切酶和内切酶双活性蛋白构建纤维素酶高产菌株的方法技术

本发明专利技术公开了一种表达纤维素外切酶和内切酶双活性蛋白构建纤维素酶高产菌株的方法，属于酶工程领域。该方法为通过同源重组和基因工程技术将具有纤维素外切酶和内切酶双活性蛋白的编码基因整合到黑曲霉热激蛋白基因的位置。首先合成核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的同源重组片段，用SalI酶切该重组片段和pWM1质粒再连接转化DH5α得到同源重组质粒；用该同源重组质粒转化农杆菌，通过农杆菌介导转化得到纤维素酶高产黑曲霉菌株。本发明专利技术利用热激表达实现了通过提高温度大幅度增加目的蛋白的表达，从而更显著的提高纤维素外切酶和内切酶的活性，增加纤维素酶的酶活。

【技术实现步骤摘要】
一种表达纤维素外切酶和内切酶双活性蛋白构建纤维素酶高产菌株的方法
本专利技术属于酶工程领域，具体涉及一种表达纤维素外切酶和内切酶双活性蛋白构建纤维素酶高产黑曲霉菌株的方法。
技术介绍
纤维素是地球上最丰富的可再生资源，地球上每年因光合作用产生的纤维素达到100亿吨左右，利用纤维素生产生物能源，是缓解能源危机、实现人类可持续发展的关键。纤维素利用的关键是把纤维素降解为可发酵性的糖类-葡萄糖。纤维素的降解需要外切酶、内切酶、葡聚糖苷酶的共同作用。其中，外切酶降解纤维素的晶体结构，是纤维素酶降解纤维素的限速步骤，内切酶降解长片段的纤维素成为二聚体，是纤维素降解的关键步骤。用纤维素酶降解纤维素具有绿色、条件温和、转化率高的特点，但是纤维素较高的生产成本成为纤维素酶降解纤维素的瓶颈。获得高产纤维素酶的菌株，降低纤维素酶的生产成本成为纤维素酶工业化利用的必由之路。纤维素酶的生产菌株主要有黑曲霉。黑曲霉由于其较高的安全性，被认为是生产纤维素酶最有应用前景的菌株之一。黑曲霉生产的纤维素酶由纤维素内切酶、葡糖苷酶和外切酶组成。其中外切酶破坏纤维素晶体结构，把晶体纤维素降解为可溶性的纤维素片段，该过程是纤维素降解的限速步骤。纤维素的高效降解需要大量的纤维素外切酶。然而，黑曲霉生产的纤维素酶中，葡糖苷酶的活性比外切酶的活性和内切酶的活性高的多。由于黑曲霉产生的纤维素外切酶活性和内切酶活性的不足，致使黑曲霉产生的纤维素酶对天然纤维素的降解效率非常低。因此增加纤维素外切酶和内切酶的活性，成为提高黑曲霉纤维素酶降解效率的重要措施。现有的增加黑曲霉纤维素酶的方法有和高外切酶活性的纤维素酶混合或黑曲霉菌株与里氏木霉混菌发酵。与高外切酶活性纤维素酶的混合，本身就增加了混合这一道工艺，增加了降解成本。而且高外切酶活性的纤维素酶成本也较高。混菌发酵由于里氏木霉产生毒素，大大限制了纤维素酶的使用范围。已报道的构建黑曲霉纤维素酶高产菌株的方法是导入的基因与黑曲霉已有纤维素酶的基因共同表达，但是表达的酶仅仅具有一种活性，不能同时增加内切酶和外切酶的活性。同时已有的基因工程菌不能通过条件（温度、酸度等）控制单一的大幅度增加某一种酶的表达，对纤维素酶酶系组成的改变有限。
技术实现思路
本专利技术的目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种表达纤维素外切酶和内切酶双活性蛋白构建纤维素酶高产黑曲霉菌株的方法。本专利技术的目的还在于提供一种基于该方法构建得到的纤维素酶高产黑曲霉菌株。本专利技术的目的通过下述技术方案实现：一种表达纤维素外切酶和内切酶双活性蛋白构建纤维素酶高产黑曲霉菌株的方法，为通过同源重组和基因工程技术将具有纤维素外切酶和内切酶双活性蛋白的编码基因整合到黑曲霉热激蛋白基因的位置。一种纤维素酶高产黑曲霉菌株，为在热激蛋白基因的位置整合有纤维素外切酶和内切酶双活性蛋白编码基因的黑曲霉菌株。所述的纤维素酶高产黑曲霉菌株的构建方法优选包含如下步骤：（1）合成黑曲霉热激蛋白基因的前段序列-纤维素外切酶和内切酶双活性蛋白的编码序列-黑曲霉热激蛋白基因的后段序列的同源重组片段，该同源重组片段两端含有限制性内切酶酶切位点；将该重组片段连接到pWM1质粒上得到同源重组质粒。（2）用同源重组质粒转化农杆菌。（3）通过农杆菌介导转化得到目的菌株。优选的，步骤（1）为：合成核苷酸序列如SEQIDNO.1所示的同源重组片段，用SalI酶切；将pWM1质粒也用SalI酶切；将酶切后的重组片段和质粒通过DNA连接酶连接，并转化DH5α得到同源重组质粒。本专利技术通过同源重组技术，合成黑曲霉热激蛋白编码序列的前后两段作为同源重组序列，把具有纤维素内切酶和外切酶的蛋白编码序列连接，通过基因工程技术，让具有纤维素内切酶和外切酶活性的蛋白整合到热激蛋白的位置，构建出热激表达的菌株，构建的菌株纤维素酶的6.7U/g，是出发菌株5.6U/g的1.2倍。本专利技术的黑曲霉菌株能够内表达外切酶和内切酶活性的蛋白，为纤维素酶的高产菌株。本专利技术最大的优点是通过表达一种蛋白，能同时增加外切酶和内切酶的活性，更具有创新意义的是利用热激表达实现了通过提高温度大幅度增加目的蛋白的表达，从而更显著的提高纤维素外切酶和内切酶的活性，增加纤维素酶的酶活。具体实施方式以下实施例用于进一步说明本专利技术的内容，但不应理解为对本专利技术的限制，在不背离本专利技术精神和实质的情况下，对本专利技术方法、步骤或条件所作的修改或替换均属于本专利技术的范围。若为特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。实施例1A、同源重组质粒的构建（1）材料：黑曲霉（Aspergillusniger）、大肠杆菌（E.coli）DH5α、农杆菌EHA105和质粒pWM1均为商业化产品。其中，黑曲霉从ATCC购买，菌株编号ATCC10582；农杆菌EHA105和质粒pMW1从Biovector公司购买。（2）同源重组片段的合成及酶切合成由黑曲霉热激蛋白基因的前段同源序列（该序列可能的起始密码子被其它碱基替代以确保转录从双活性蛋白的起始密码子开始，序列如SEQIDNO.2所示）—纤维素外切酶和内切酶双活性蛋白的编码序列（SEQIDNO.3）—黑曲霉热激蛋白基因的后段同源序列（SEQIDNO.4）组成的同源重组片段（核苷酸序列如SEQIDNO.1所示）。往100μL该同源重组片段中加入SalI酶液2μL（TakaRa购买），30℃酶切16h，酶切后65℃水浴10min。（3）pWM1质粒的提取及酶切含有pWM1质粒的大肠杆菌E.coliDH5α于LB中（50μg/mL的卡那霉素）37℃振荡培养12h。取1.5mL菌体于EP管，以4000rpm离心3min，弃上清液。加0.1mL溶液I（1%葡萄糖，50mMEDTApH8.0，25mMTris-HClpH8.0）充分混合。加入0.2mL溶液II（0.2mMNaOH，1%SDS），轻轻翻转混匀，置于冰浴5min。加入0.15mL预冷溶液III（5mol/LKAc，pH4.8），轻轻翻转混匀，冰浴5min。以10000rpm离心20min，取上清液于另一新EP管。加入等体积的异戊醇，混匀后静置10min。再以10000rpm离心20min，弃上清。用70%乙醇0.5mL洗涤一次，抽干所有液体。待沉淀干燥后，溶于0.05mLTE缓冲液中。提取的pWM1质粒50μL加入SalI酶液2μL（TakaRa购买），30℃酶切16h，酶切后65℃水浴10min。（4）连接酶切的同源重组片段100μL和酶切的pWM1质粒20μL用5μLT4DNAligase（TakaRa购买）16℃连接24h。B、大肠杆菌感受态细胞的制备（1）将E.coliDH5α置于LB培养基上，在37℃下过夜培养。（2）高温灭菌大的离心瓶（250-500mL）以备第二天摇瓶用。（3）准备几瓶灭菌水（总量约1.5升），保存于冷冻室中以备第二天重悬浮细胞用。（4）转移0.2-1mL过夜培养物至装有20mLLB（或其他营养丰富的培养基）的100mL摇瓶。（5）37℃下剧烈振荡培养6小时。（6）监控培养液OD600值（培养1小时后每半小时测定一次）。（7）当OD600值达到0.5-1.0时，从摇床中取出摇瓶，置于冰上冷却15分钟。（8）细胞在4℃5000g本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种表达纤维素外切酶和内切酶双活性蛋白构建纤维素酶高产黑曲霉菌株的方法，其特征在于：为将具有纤维素外切酶和内切酶双活性蛋白的编码基因整合到黑曲霉热激蛋白基因的位置。

【技术特征摘要】
1.一种纤维素酶高产黑曲霉菌株，其特征在于：通过包括如下步骤的构建方法得到：(1)合成核苷酸序列如SEQIDNO.1所示的同源重组片段，用SalI酶切；将pWM1质粒也用SalI酶切；将酶切后的重组片段和质粒通过DNA连接酶连接，并转化DH5α得到同源重组质粒；(2)用同源重组质粒转化农杆菌；(3)通过农杆菌介导转化黑曲霉ATCC10582得到目的菌株。...

【专利技术属性】
技术研发人员：薛栋升，
申请(专利权)人：湖北工业大学，
类型：发明
国别省市：湖北;42