高产2,3-丁二醇的产酸克雷伯氏基因工程菌株的构建方法及其发酵方法技术

高产2,3-丁二醇的产酸克雷伯氏基因工程菌株的构建方法及其发酵方法，涉及一种高产2,3-丁二醇的基因工程菌株的构建方法及其发酵方法。本发明专利技术是为了解决目前产酸克雷伯氏菌产2,3-丁二醇产量低、转化率低、生产强度低及纯度低的问题。构建方法：一、ldh基因同源左臂片段ldh-L和右臂片段ldh-R的构建；二、pldh-L和pldh-R质粒构建；三、pldh-LR质粒构建；四、pT-Cmr质粒构建；五、同源重组片段ldhL-Cmr-ldhR的构建；六、K.oxytoca HD79/pKD46菌株构建；七、ldhL-Cmr-ldhR转化K.oxytoca HD79/pKD46。发酵方法：一、将产酸克雷伯氏基因工程菌株接种到种子培养基中，培养至对数生长期，得种子液；二、将种子液接种到发酵培养基中，底物葡萄糖150g/L，发酵，结束。本发明专利技术用于生产2,3-丁二醇。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种高产2,3-丁二醇的基因工程菌株的构建方法及其发酵方法。
技术介绍
产酸克雷伯氏菌(Klebisellaoxytoca)作为2,3-丁二醇的产生菌，具有适应环境能力强、底物范围广、代谢彻底、副产物较少、产物浓度和转化率较高等优点被认为是工业化生产的潜在菌株。但是，酸性副产物乳酸的积累仍是限制2,3-丁二醇产量提高的主要因素，发酵过程中乳酸含量的增加，会抑制菌体的生长，不但降低了2,3-丁二醇的产量，同时增加了后续对2,3-丁二醇分离纯化的复杂性。另外，还存在2,3-丁二醇转化率低、生产强度低及纯度低的技术问题。
技术实现思路
本专利技术是为了解决目前产酸克雷伯氏菌产2,3-丁二醇产量低、转化率低、生产强度低及纯度低的问题，提供高产2,3-丁二醇的产酸克雷伯氏基因工程菌株的构建方法及其发酵方法。本专利技术高产2,3-丁二醇的产酸克雷伯氏基因工程菌株的构建方法，按以下步骤进行：一、ldh基因同源左臂片段ldh-L和右臂片段ldh-R的构建：以产酸克雷伯氏菌HD79基因组DNA为模板，分别用ldh-L1、ldh-L2和ldh-R1、ldh-R2引物进行PCR反应；二、pldh-L和pldh-R质粒构建：向含有ldh基因同源左臂片段和右臂片段的PCR反应体系中加入0.25μLTaq(5U/μL)DNA聚合酶，72℃水浴中反应10min，将目的条带胶回收纯化，获得片段ldh-L和ldh-R，将片段ldh-L和ldh-R分别与pMD18-T载体连接，获得克隆载体分别命名为pldh-L和pldh-R；三、pldh-LR质粒构建：以pldh-L为骨架，选用限制性内切酶XhoI和EcoRI对质粒载体pldh-L与pldh-R分别进行双酶切，用T4DNA连接酶将pldh-R的酶切产物连接到pldh-L质粒载体上，得到重组质粒pldh-LR；四、pT-Cmr质粒构建：以pGP704-Cm为模板，利用Cm-up和Cm-down为扩增引物，对Cmr进行PCR扩增，对PCR产物进行TA克隆，得到pT-Cmr质粒；五、同源重组片段ldhL-Cmr-ldhR的构建：以重组质粒pldh-LR为骨架，选用限制性内切酶XhoI对重组质粒pT-Cmr和pldh-LR进行酶切，将获得的Cmr片段插入质粒载体pldh-LR中，构建质粒载体pT-LCR；选择限制性内切酶BamHI与BglII对重组质粒pT-LCR进行酶切，获得同源重组片段ldhL-Cmr-ldhR；六、K.oxytocaHD79/pKD46菌株构建：将质粒pKD46电转化到K.oxytocaHD79感受态细胞，得到K.oxytocaHD79/pKD46菌株；七、同源重组片段ldhL-Cmr-ldhR转化K.oxytocaHD79/pKD46：将同源重组片段ldhL-Cmr-ldhR电转化到K.oxytocaHD79/pKD46中，得到的目的菌株为高产2,3-丁二醇的产酸克雷伯氏基因工程菌株K.ocytocaHD79-01。步骤一所述产酸克雷伯氏菌(K.oxytoca)HD79已在文献《KlebisellaoxytocaHD79乙酸激酶部分基因(ack)的克隆与序列分析》(中国农学通报，2015。31(14):83-88)中公开。上述方法构建的产酸克雷伯氏基因工程菌株的发酵方法，按以下步骤进行：一、将产酸克雷伯氏基因工程菌株K.oxytocaHD79-01单菌落接种到种子液培养基中，30℃，150r/min培养至对数生长期，得种子液；二、然后将种子液以5％的接种量接种到装液量为150mL/500mL的发酵培养基中，于30℃，150r/min发酵156h后结束。步骤一中所述种子液培养基配方：(NH4)2SO41g/L、K2HPO4·3H2O3.4g/L、KH2PO41.3g/L、MgSO40.2g/L、酵母提取物1g/L、微量元素2mL/L和铁溶液1mL/L，调pH值至7.0，121℃高压灭菌15min，之后向每100mL种子培养基中加入经108℃高压灭菌20min的5g葡萄糖粉末；步骤二中所述发酵培养基配方：(NH4)2SO46.6g/L、K2HPO4·3H2O8.7g/L、KH2PO46.8g/L、MgSO4·7H2O0.25g/L、酵母提取物5g/L、FeSO4·7H2O0.05g/L、ZnSO4·7H2O0.001g/L、MnSO4·7H2O0.001g/L和CaCl2·2H2O0.001g/L，调整溶液的pH值至7.0，121℃高压灭菌15min，然后在其中加入经108℃高压灭菌20min的葡萄糖粉末至浓度为150g/L。本专利技术的原理：ldh基因编码的乳酸脱氢酶是乳酸代谢途径的关键酶，本专利技术利用λRed同源重组技术对K.oxytocaHD79中ldh基因敲除，阻断乳酸的生成途径，促使碳流量更多流向2,3-丁二醇，以期获得2,3-丁二醇高产菌株。首先，通过PCR技术扩增得到乳酸脱氢酶基因的同源左右两臂片段，然后将该两臂片段连接到氯霉素抗性基因的左右两翼，形成一个表达盒ldhL-Cmr-ldhR。将该表达盒转入产酸克雷伯氏菌中，通过同源重组的方式，以氯霉素抗性基因替代乳酸脱氢酶基因，从而完成对乳酸脱氢酶基因的敲除。获得突变株由于不能有效的产生乳酸，使菌株代谢通路发生改变，提高了2,3-丁二醇的产量。本专利技术的有益效果：本专利技术成功敲除产酸克雷伯氏菌(Klebisellaoxytoca)HD-79的ldh基因，构建KlebisellaoxytocaHD-79-01菌株，减少乳酸的产量，提高了2,3-丁二醇的产量。其中2,3-丁二醇的产量由31.71g/L提高到40.20g/L，提高了26.8％。而乳酸则由4.83g/L下降到2.45g/L，降低了49.3％。2,3-丁二醇转化率提高了11.8％；2,3-丁二醇的生产强度由0.33(g/L·h)增加到0.48(g/L·h)，提高了45.5％。另外，利用该菌株获得的2,3-丁二醇纯度由59.7％增加到67.8％。本专利技术关于基因敲除高效生产2,3-丁二醇的构建研究将为今后基因功能的研究提供理论依据。附图说明图1为ldh-L基因和ldh-R基因PCR扩增产物电泳图；图2为ldh-L基因阳性克隆菌液PCR验证结果；其中M为DNAMarkerDL2000，泳道1-5为阳性克隆菌液PCR扩增产物；图3为ldh-R基因阳性克隆菌液PCR验证结果；其中M为DNA本文档来自技高网...

【技术保护点】
高产2,3‑丁二醇的产酸克雷伯氏基因工程菌株的构建方法，其特征在于该方法按以下步骤进行：一、ldh基因同源左臂片段ldh‑L和右臂片段ldh‑R的构建：以产酸克雷伯氏菌HD79基因组DNA为模板，分别用ldh‑L1、ldh‑L2和ldh‑R1、ldh‑R2引物进行PCR反应；二、pldh‑L和pldh‑R质粒构建：向含有ldh基因同源左臂片段和右臂片段的PCR反应体系中加入0.25μL 5U/μL的TaqDNA聚合酶，72℃水浴中反应10min，将目的条带胶回收纯化，获得片段ldh‑L和ldh‑R，将片段ldh‑L和ldh‑R分别与pMD18‑T载体连接，获得克隆载体分别命名为pldh‑L和pldh‑R；三、pldh‑LR质粒构建：以pldh‑L为骨架，选用限制性内切酶Xho I和EcoR I对质粒载体pldh‑L与pldh‑R分别进行双酶切，用T4DNA连接酶将pldh‑R的酶切产物连接到pldh‑L质粒载体上，得到重组质粒pldh‑LR；四、pT‑Cmr质粒构建：以pGP704‑Cm为模板，利用Cm‑up和Cm‑down为扩增引物，对Cmr进行PCR扩增，对PCR产物进行TA克隆，得到pT‑Cmr质粒；五、同源重组片段ldhL‑Cmr‑ldhR的构建：以重组质粒pldh‑LR为骨架，选用限制性内切酶Xho I对重组质粒pT‑Cmr和pldh‑LR进行酶切，将获得的Cmr片段插入质粒载体pldh‑LR中，构建质粒载体pT‑LCR；选择限制性内切酶BamH I与Bgl II对重组质粒pT‑LCR进行酶切，获得同源重组片段ldhL‑Cmr‑ldhR；六、K.oxytoca HD79/pKD46菌株构建：将质粒pKD46电转化到K.oxytoca HD79感受态细胞，得到K.oxytoca HD79/pKD46菌株；七、同源重组片段ldhL‑Cmr‑ldhR转化K.oxytoca HD79/pKD46：将同源重组片段ldhL‑Cmr‑ldhR电转化到K.oxytoca HD79/pKD46中，得到的目的菌株为高产2,3‑丁二醇的产酸克雷伯氏基因工程菌株K.ocytoca HD79‑01。...

【技术特征摘要】
1.高产2,3-丁二醇的产酸克雷伯氏基因工程菌株的构建方法，其特征在于该方法按以
下步骤进行：
一、ldh基因同源左臂片段ldh-L和右臂片段ldh-R的构建：
以产酸克雷伯氏菌HD79基因组DNA为模板，分别用ldh-L1、ldh-L2和ldh-R1、ldh-R2引物
进行PCR反应；
二、pldh-L和pldh-R质粒构建：
向含有ldh基因同源左臂片段和右臂片段的PCR反应体系中加入0.25μL5U/μL的
TaqDNA聚合酶，72℃水浴中反应10min，将目的条带胶回收纯化，获得片段ldh-L和ldh-R，将
片段ldh-L和ldh-R分别与pMD18-T载体连接，获得克隆载体分别命名为pldh-L和pldh-R；
三、pldh-LR质粒构建：
以pldh-L为骨架，选用限制性内切酶XhoI和EcoRI对质粒载体pldh-L与pldh-R分别
进行双酶切，用T4DNA连接酶将pldh-R的酶切产物连接到pldh-L质粒载体上，得到重组质粒
pldh-LR；
四、pT-Cmr质粒构建：
以pGP704-Cm为模板，利用Cm-up和Cm-down为扩增引物，对Cmr进行PCR扩增，对PCR产物
进行TA克隆，得到pT-Cmr质粒；
五、同源重组片段ldhL-Cmr-ldhR的构建：
以重组质粒pldh-LR为骨架，选用限制性内切酶XhoI对重组质粒pT-Cmr和pldh-LR进行
酶切，将获得的Cmr片段插入质粒载体pldh-LR中，构建质粒载体pT-LCR；
选择限制性内切酶BamHI与BglII对重组质粒pT-LCR进行酶切，获得同源重组片段
ldhL-Cmr-ldhR；
六、K.oxytocaHD79/pKD46菌株构建：
将质粒pKD46电转化到K.oxytocaHD79感受态细胞，得到K.oxytocaHD79/pKD46菌株；
七、同源重组片段ldhL-Cmr-ldhR转化K.oxytocaHD79/pKD46：
将同源重组片段ldhL-Cmr-ldhR电转化到K.oxytocaHD79/pKD46中，得到的目的菌株为
高产2,3-丁二醇的产酸克雷伯氏基因工程菌株K.ocytocaHD79-01。
2.根据权利要求1所述的高产2,3-丁二醇的产酸克雷伯氏基因工程菌株的构建方法，
其特征在于步骤一中ldh-L1引物序列为5’-GGAAGATCTCAGTACGACAAGAAGTATCTG-3’，ldh-...

【专利技术属性】
技术研发人员：葛菁萍，孙姗姗，叶广斌，宋刚，平文祥，修宝林，
申请(专利权)人：黑龙江大学，
类型：发明
国别省市：黑龙江;23