一种高产果胶甲酯酶的黑曲霉菌株制造技术

本发明专利技术涉及基因工程技术领域，具体涉及一种高产果胶甲酯酶的黑曲霉菌株。所述黑曲霉菌株在20L罐发酵后上清液中果胶甲酯酶酶活高达421u/ml。所述黑曲霉重组菌株可广泛应用于果胶甲酯酶的生产，从而有利于降低果胶甲酯酶的生产成本，促进其在果汁加工领域中的推广与应用。

Aspergillus niger strain with high yield of pectin esterase

The invention relates to the technical field of gene engineering, in particular to a strain of Aspergillus niger with high yield of pectin esterase. After the fermentation of 20L strain, the activity of pectin esterase in the supernatant of the Aspergillus niger strain was as high as 421u/ml. The recombinant strain of Aspergillus niger can be widely applied to fruit gum methylesterase production, so as to reduce the production cost of pectinesterase, promote the popularization and application in the field of fruit juice processing.

【技术实现步骤摘要】
一种高产果胶甲酯酶的黑曲霉菌株
本专利技术属于基因工程
，具体内容涉及一种高产果胶甲酯酶的黑曲霉菌株及其应用。技术背景在现代工业中果胶是一种重要的物品，例如它可以在诸如果酱制品的视频工业中用作增稠剂或胶凝剂。在细胞壁的果胶降解过程中各种果胶酶都发挥了独特作用。其中果胶溶酶(PL)能够水解果胶产生水溶性果胶，切断聚甲氧基半乳糖醛酸和阿拉伯糖之间的化学键；多聚半乳糖醛酸酶(PG)能切断果胶酸的a-1,4糖苷键形成游离的半乳糖醛酸；果胶甲酯酶(PME)的作用位点具体地说，是果胶分子的还原性末端或其邻近的游离羧基，对多聚半乳糖醛酸甲酯有高度的专一性，能水解水溶性果胶分子中甲氧基(-OCH2)与半乳糖醛酸之间的酯键，沿着分子以单链机制进行，从而形成对二价阳离子异常敏感的果胶酸和甲醇，再经过PG作用形成游离的半乳糖醛酸。果胶甲酯酶(Pectinmethylesterase,PME)是一种能催化、水解果胶生成果胶酸和甲醇的重要的果胶酶，普遍存在于高等植物的不同组织器官，如根、茎、叶、果实等。其对细胞壁组成和降解，细胞游离、花粉发育、种子萌发、根尖延伸、种子开裂、果实软化成熟、抗病等方面具有重要作用。目前在食品加工、茶饮料、造纸等生产工艺中已广泛利用果胶甲酯酶的活性来改善产品品质。对果胶酯酶结构和基因方面的研究，目前研究的最多的是蕃茄和柑橘中的果胶酯酶。但也有不少学者将果胶酯酶从草莓、烟草以及一些真菌中得到克降与表达。随着基因工程技术的发展，从微生物中克隆果胶甲酯酶基因，构建高效表达体系，诱导果胶甲酯酶表达，这是获得大量果胶甲酯酶的新途径之一。例如，从菊欧文氏菌B374克隆果胶甲酯酶，在枯草芽孢杆菌中进行表达，可以获得没有外源污染的果胶甲酯酶。从米曲霉KBN616克隆果胶甲酯酶基因(pmeA)，在黑曲霉中进行超量表达，其果胶甲酯酶可用于降解大豆果胶，制备豆酱。较于国外，国内对果胶甲酯酶基因工程的研究还比较缓慢，通过基因工程手段改造宿主细胞，提高果胶甲酯酶的表达量，以促进酶工业和食品工业的进一步发展是本专利技术的研究重点。
技术实现思路
本专利技术为解决现有技术问题，提供了一株高产果胶甲酯酶的黑曲霉菌株。申请人在出发菌黑曲霉Su（AspergillusnigerSu）中敲除了EG、PL、PG1和PG2四个基因，构建得到新的宿主菌黑曲霉Su4，并在黑曲霉Su4中过表达果胶甲酯酶，能大大提高果胶甲酯酶的产量，为该酶的广泛应用奠定了基础。本专利技术一方面涉及一种新的宿主细胞黑曲霉Su4（AspergillusnigerSu4），其缺失了糖化酶、α淀粉酶、高峰淀粉酶、葡聚糖酶、果胶裂解酶、聚半乳糖醛酸酶1和聚半乳糖醛酸酶2七个基因。所述糖化酶基因的编码核苷酸序列为SEQIDNO:3；所述α淀粉酶基因的编码核苷酸序列为SEQIDNO:4；所述高峰淀粉酶基因的编码核苷酸序列为SEQIDNO:5；所述葡聚糖酶基因的编码核苷酸序列为SEQIDNO:6；所述果胶裂解酶基因的编码核苷酸序列为SEQIDNO:7；所述聚半乳糖醛酸酶1基因的编码核苷酸序列为SEQIDNO:8；所述聚半乳糖醛酸酶2基因的编码核苷酸序列为SEQIDNO:9。本专利技术另一方面涉及一种重组菌株，是将携带有果胶甲酯酶基因的表达载体转化入上述宿主细胞获得的。所述果胶甲酯酶的氨基酸序列为SEQIDNO：1，其编码核苷酸序列为SEQIDNO：2。所述重组菌株命名为黑曲霉Su4-PME（AspergillusnigerSu4-PME），已于2016年12月22日保藏于中国武汉武汉大学的中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCCNO:M2016778。所述重组菌株在果胶甲酯酶生产中的应用。本专利技术构建的以黑曲霉Su为宿主细胞构建得到的重组表达果胶甲酯酶PME的工程菌株黑曲霉Su-PME，其摇瓶发酵上清液中果胶甲酯酶活力为33u/ml，20L罐发酵上清液中果胶甲酯酶活力为256u/ml；以黑曲霉Su4为宿主细胞构建得到的重组表达果胶甲酯酶PME的工程菌株黑曲霉Su4-PME，其发酵上清液中果胶甲酯酶活力高达58u/ml，比黑曲霉Su-PME提高了75.8%，20L罐发酵上清液中果胶甲酯酶酶活高达421u/ml，比黑曲霉Su-PME提高了64.5%。从而说明本专利技术通过敲除宿主菌黑曲霉Su中的EG、PL、PG1和PG2四个基因，能显著提高果胶甲酯酶基因的表达效率，使果胶甲酯酶的表达量提高60%以上，取得了意料不到的技术效果。所述黑曲霉重组菌株可广泛应用于果胶甲酯酶的生产，从而有利于降低果胶甲酯酶的生产成本，促进其在果汁加工领域中的推广与应用。附图说明图1为质粒pGAU图谱；图2为黑曲霉菌株发酵液SDS-PAGE蛋白电泳图：其中：M为蛋白分子量Marker，泳道1、2分别为黑曲霉Su-PME、Su4-PME发酵上清液；图3为黑曲霉菌株Su-PME、Su4-PME20L罐发酵曲线。具体实施方式本专利技术用到了遗传工程和分子生物学领域使用的常规技术和方法，例如MOLECULARCLONING:ALABORATORYMANUAL,3ndEd.(Sambrook,2001)和CURRENTPROTOCOLSINMOLECULARBIOLOGY(Ausubel,2003)中所记载的方法。这些一般性参考文献提供了本领域技术人员已知的定义和方法。但是，本领域的技术人员可以在本专利技术所记载的技术方案的基础上，采用本领域其它常规的方法、实验方案和试剂，而不限于本专利技术具体实施例的限定。本专利技术实施例中所选用的宿主细胞黑曲霉Su（AspergillusnigerSu），是专利技术人徐晓东于2015年3月在野生型黑曲霉的基础上敲除了糖化酶（glucoamylase）、α淀粉酶（α-amylase）、高峰淀粉酶（TAKA-amylase）3个基因得到的菌株，所述三个基因的编码核苷酸序列分别为SEQIDNO:3，SEQIDNO:4，SEQIDNO:5。下面结合具体实施方式对本专利技术进行详细描述。实施例1葡聚糖酶（endoglucanase，简称EG）基因敲除以黑曲霉Su（AspergillusnigerSu）基因组为模板，利用引物EGU-F、EGU-R扩增葡聚糖酶基因上游序列，利用引物EGD-F、EGD-R扩增葡聚糖酶基因下游序列。葡聚糖酶基因的编码核苷酸序列为SEQIDNO:6。PCR引物和反应条件如下：引物EGU-F：TCAAAATCTCGGAAGGAC引物EGU-R：GGACGAAGTAAGCCAACTA引物EGD-F：TTAAATTCCGAGCCAGTC引物EGD-R：AACAAGAAATACGCACCC扩增条件为：94℃变性5min；然后94℃变性30s，56℃复性30s，72℃延伸90s，30个循环后，72℃保温10min。琼脂糖电泳结果显示，上游序列EGU大小为1434bp，下游序列EGD大小为1506bp。将上述获得的上下游序列EGU、EGD片段分别通过KpnI、SphI与敲除载体pMD18T-pyrE连接，构建敲除载体pQC-EG，其中上下游序列EGU、EGD分别位于筛选标记pyrE两侧。原生质体制备：接种宿主菌黑曲霉Su于PDA+U（马铃薯200g/L，煮沸20-30min后过滤除渣；葡萄糖2%；Uridi本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种黑曲霉菌株，其特征在于，所述的黑曲霉菌株缺失了糖化酶、α淀粉酶、高峰淀粉酶、葡聚糖酶、果胶裂解酶、聚半乳糖醛酸酶1和聚半乳糖醛酸酶2七个基因。

【技术特征摘要】
1.一种黑曲霉菌株，其特征在于，所述的黑曲霉菌株缺失了糖化酶、α淀粉酶、高峰淀粉酶、葡聚糖酶、果胶裂解酶、聚半乳糖醛酸酶1和聚半乳糖醛酸酶2七个基因。2.如权利要求1所述的黑曲霉菌株，其特征在于，所述的糖化酶基因的编码核苷酸序列为SEQIDNO:3；所述的α淀粉酶基因的编码核苷酸序列为SEQIDNO:4；所述的高峰淀粉酶基因的编码核苷酸序列为SEQIDNO:5；所述的葡聚糖酶基因的编码核苷酸序列为SEQIDNO:6；所述的果胶裂解酶基因的编码核苷酸序列为SEQIDNO:7；所述的聚半乳糖醛酸酶1基因的编码核苷酸序列为S...

【专利技术属性】
技术研发人员：徐晓东，张珍珍，徐娟，刘文瑶，
申请(专利权)人：青岛蔚蓝生物集团有限公司，
类型：发明
国别省市：山东,37