一种高产D‑乳酸的重组菌及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种高产D‑乳酸的重组菌及其应用，属于生物工程领域。本发明专利技术提供的重组菌，是将D‑乳酸脱氢酶基因ldhA在肺炎克雷伯氏菌过量表达，得到重组肺炎克雷伯氏菌。本发明专利技术D‑乳酸生产方法是将重组菌活化后进行逐级扩大培养，实现了500L发酵罐水平上的中试生产。本发明专利技术简单易行，实现了D‑乳酸在中试水平上的高效合成，产量达到210g/L，且不含有L‑乳酸，具有产量高、生产成本较低的特点，具有良好的市场前景和经济效益。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种高产D-乳酸的重组菌及其应用，属于生物工程领域。
技术介绍
随着现代社会的快速发展，人类社会生活更加要求便利化。为了顺应这种需求，一次性泡沫塑料盒、塑料袋、餐具、水杯等塑料制品大规模进入人们的日常生活。这些塑料制品在给人类带来便利的同时，加剧了由此带来的“白色污染”问题。开发和制造可降解塑料产品成为解决这一问题的关键。聚乳酸是一种新型的生物降解材料，具有良好的机械性能、物理性能和生物相容性，主要通过缩聚法将乳酸单体聚合而成。根据乳酸单体的不同，聚乳酸可以分为聚L-乳酸、聚D-乳酸和聚LD-乳酸。高光学纯度D-乳酸可以作为制备聚乳酸的优良单体。将D-乳酸聚合单体以一定比例加入聚L-乳酸后，可以得到LD-乳酸，其机械性能、热力学性能等都会得到改善，熔点能够提高50℃左右。全球聚乳酸市场每年约以20％～30％的速率增长，促进了D-乳酸需求量的快速增加(甄光明.生物产业技术,2015(1):42-52)。现有技术中，微生物法生产D-乳酸的研究相对较少，且存在诸多问题，例如传统的乳酸发酵菌种，只能同时合成L-乳酸和D-乳酸，且产物光学纯度比较差，难以用于聚乳酸的合成。现有的工程菌株，其产量和转化率较低，生产成本较高，不利于实现产业化发展。
技术实现思路
本专利技术的第一个目的在于提供一种高产D-乳酸的重组菌，是将D-乳酸脱氢酶基因ldhA导入宿主肺炎克雷伯氏菌中进行过量表达，获得重组菌。在本专利技术的一种实施方式中，所述D-乳酸脱氢酶基因ldhA，来源于肺炎克雷伯氏菌(Klebsiellapneumoniae)基因，Genbank登录号为CP000964.1。本专利技术的第二个目的是提供所述重组菌的构建方法，是以pBAD18为载体，将D-乳酸脱氢酶基因ldhA在肺炎克雷伯氏菌中进行过量表达。在本专利技术的一种实施方式中，所述D-乳酸脱氢酶基因ldhAGenbank登陆号为CP000964.1，其序列如SEQIDNO.1所示。在本专利技术的一种实施方式中，所述方法具体是：1)克隆D-乳酸脱氢酶基因ldhA，将所得基因与质粒pBAD18酶切，回收酶切后的片段和载体；2)将步骤1)所得的载体和目的片段以等摩尔比混合后利用连接酶连接，构建重组载体pBAD18-LdhA并转入感受态细胞中，筛选阳性克隆；3)培养步骤2)所得的阳性克隆，提取质粒，将所得的重组质粒pBAD18-LdhA转化到宿主肺炎克雷伯氏菌中，获得重组肺炎克雷伯氏菌。在本专利技术的一种实施方式中，步骤2)所述连接酶为T4DNA连接酶，连接时间为6～12小时。在本专利技术的一种实施方式中，步骤2)所述感受态细胞为E.coliDH5α感受态细胞。在本专利技术的一种实施方式中，步骤2)所述筛选是利用卡那霉素抗性平板过夜培养，再通过菌落PCR进行筛选。在本专利技术的一种实施方式中，步骤3)所述转化采用电击转化法。本专利技术的第三个目的是提供应用所述重组肺炎克雷伯氏菌生产D-乳酸的方法，所述方法是将所述重组肺炎克雷伯氏菌接种至发酵培养基中，35～37℃，通气0.5～2.5vvM的条件下发酵24～72h；发酵过程中加入阿拉伯糖进行诱导，并通过补加甘油溶液维持培养基中甘油浓度为5～10g/L。在本专利技术的一种实施方式中，所述培养基碳源为甘油，氮源为包括氯化铵、硫酸铵在内的无机氮源。在本专利技术的一种实施方式中，所述发酵培养基是改良M9培养基，其配方为：0.3～0.5g/L一水合柠檬酸，1.2～2g/LNH4Cl，0.1～0.4g/LMgSO4·7H2O，100mmol/LpH＝7.0磷酸钾缓冲液，15～25g/L甘油。在本专利技术的一种实施方式中，所述接种是以10～15mL/100mL培养基的比例接种。在本专利技术的一种实施方式中，在菌体培养至OD600为3～5时加入终浓度0.1～5g/L的阿拉伯糖诱导D-乳酸脱氢酶表达，之后每隔12h以相同添加量添加一次阿拉伯糖。在本专利技术的一种实施方式中，所述方法是第一次添加阿拉伯糖后继续发酵24～72小时。在本专利技术的一种实施方式中，所述方法维持发酵液pH为6.5～7.5在本专利技术的一种实施方式中，所述方法维持培养基中甘油浓度为5～10g/L。在本专利技术的一种实施方式中，所述接种前经过逐级扩大培养。在本专利技术的一种实施方式中，所述逐级扩大培养是先在LB培养基中进行活化，再在发酵培养基中进行扩大培养。在本专利技术的一种实施方式中，所述方法具体是：1)在LB培养基中进行活化，得到一级种子液；2)将步骤1)所得的一级种子液，以种子液：培养基为5～15：100的体积比将种子液接种到50L发酵罐中，培养至OD600为8～10，获得二级种子液；3)将步骤2)所得二级种子液，以种子液：培养基为10～15：100的体积比将种子液接种到500L发酵罐中培养至OD600为3～5，获得发酵液；4)在步骤3)获得的培养液中加入终浓度为0.01％～0.5％阿拉伯糖，然后转入30～33℃，80～200rpm条件下发酵24～72小时。在本专利技术的一种实施方式中，步骤1-3所述培养基的起始的pH值为7.0，培养基中添加卡那霉素。步骤2)所述培养，培养条件为：35℃～37℃，180～220rpm，空气通入速率0.5～2.5vvM。在本专利技术的一种实施方式中，步骤4)所述培养过程中补加60％～80％的甘油溶液，维持培养基中甘油浓度为5～10g/L。在本专利技术的一种实施方式中，所述方法是将重组菌在含有卡那霉素的适宜培养基中，35℃～37℃，180～220rpm，进行活化获得一级种子液；再将一级种子液以5～15：100的体积比接种至含有卡那霉素的培养基的50L发酵罐中，35℃～37℃，180～220rpm，通气0.5～2.5vvM条件下培养至OD600在8～10，获得二级种子液；将二级种子液以10～15:100的体积比接种到500L发酵罐中，35～37℃，80～200rpm，通气0.5～2.5vvM条件下培养至OD600为3～5时加入终浓度为0.1～5g/L的阿拉伯糖；再于30～33℃，继续培养24～72小时；培养过程中，补加碱溶液维持pH为6.5～7.5；每隔12h添加0.1～5g/L阿拉伯糖和50mg～100mg/L的卡那霉素；补加60％～80％的甘油溶液以维持培养基中甘油浓度为5～10g/L。有益效果：本专利技术以Klebsiellapneumoniae为宿主菌株，过表达D-乳酸脱氢酶基因ldhA构建重组菌株。通过条件优化，逐步放大培养，实现了以廉价甘油为碳源，在500L发酵罐水平的D-乳酸高效合成。发酵60h后重组菌D-乳酸产量达210g/L，转化率为理论转化率的90％，光学纯度高，不含有L-乳酸，对于D-乳酸的产业化具有示范意义。附图说明图1为发酵液中D-乳酸HPLC色谱图。具体实施方式下面结合实例来进一步阐明本专利技术。下述使用的50L和500L发酵罐由上海高机生物工程有限公司制造，所用酶试剂购自MBIFermentas公司，提取质粒所用的试剂盒和回收DNA片段所用的试剂盒购自美国OMEGA公司，相应的操作步骤按照产品说明书进行；所有培养基如无特别说明均用去离子水配制。培养基配方：1)活化培养基LB培养基：5g/L酵母粉，10g/LNaCl，10g/L蛋白胨。2)一级种子培养基本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种高产D‑乳酸的重组菌，其特征在于，将D‑乳酸脱氢酶基因ldhA导入宿主肺炎克雷伯氏菌中进行过量表达，获得重组菌。

【技术特征摘要】
1.一种高产D-乳酸的重组菌，其特征在于，将D-乳酸脱氢酶基因ldhA导入宿主肺炎克雷伯氏菌中进行过量表达，获得重组菌。2.根据权利要求1所述的重组菌，其特征在于，所述D-乳酸脱氢酶基因ldhA，Genbank登录号为CP000964.1。3.权利要求1所述重组菌的构建方法，其特征在于，以pBAD18为载体，将D-乳酸脱氢酶基因ldhA在肺炎克雷伯氏菌中进行过量表达；所述D-乳酸脱氢酶基因ldhAGenbank登陆号为CP000964.1。4.应用权利要求1或2所述重组肺炎克雷伯氏菌生产D-乳酸的方法，其特征在于，所述方法是将所述重组菌接种至发酵培养基中，33～35℃，空气通入速率0.5～2.5vvM发酵24～72h；发酵过程中维持培养基中甘油浓度为5～10g/L。5.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述发酵培养基配方为：0....

【专利技术属性】
技术研发人员：赵广，冯新军，程涛，咸漠，
申请(专利权)人：中国科学院青岛生物能源与过程研究所，
类型：发明
国别省市：山东;37