一种胞苷高产微生物菌株的高通量筛选方法技术

本发明专利技术公开了一种胞苷高产微生物菌株的高通量筛选方法。它是将单菌落接种于装有液体种子培养基的深孔板I中，摇床震荡培养，然后将深孔板I孔中的种子液对应接种到装有发酵培养基的深孔板II中，摇床震荡培养后，将深孔板离心，取上清液测胞苷含量。在酶标板的微孔中加入发酵液上清、缓冲液和适量的胞苷脱氨酶，于30-40℃温浴反应10-40min；反应结束后立即加入反应液A和反应液B，于30-40℃温浴反应20-50min，然后采用酶标仪测定反应液的吸光度值，根据标准曲线和发酵液上清的稀释倍数计算胞苷产量。本发明专利技术实现了高通量培养、发酵液的高通量制备及胞苷的高通量测定的目标。

High throughput screening method for high yield strain of cytidine

The invention discloses a high throughput screening method for high yield strain of cytidine. It is the deep plate single colony inoculated with liquid seed culture medium I, shaking bed cultivation, then the seed liquid inoculation in I hole deep plate corresponding to deep plate with II fermentation medium in shaking bed after culture, the deep plate centrifugal supernatant was measured, cytidine content. Join the fermentation supernatant of buffer, and the amount of cytidine deaminase in micro ELISA plate, 30-40 warm bath reaction 10-40min; reaction liquid is added into the reaction solution A and B immediately after the end of the reaction, 30-40 20-50min reaction in warm bath, and then were determined by enzyme reaction liquid calibration absorbance value calculation cytidine production according to the standard curve and the dilution of the fermentation supernatant. The invention realizes the goal of high throughput cultivation, high throughput preparation of fermentation liquid and high throughput determination of cytidine.

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种胞苷高产微生物菌株的高通量筛选方法，属于微生物育种和发酵工程

技术介绍
胞苷(cytidine)又名胞嘧啶核苷、胞啶、1-β-D-呋喃核苷胞嘧啶。胞苷作为嘧啶核苷主要用于生产抗肿瘤、抗病毒药物的中间体，是制造阿糖胞苷(Ara-CR)、环胞苷(CycloC)、三磷酸胞苷(CTP)、胞二磷胆碱(CDP-Choline)等药物的主要原料。目前胞苷的生产方法有RNA水解法、发酵法和合成法相结合、以尿嘧啶为前体的发酵法、直接发酵法等（张克旭，杜连祥，译.核酸发酵[M].北京:中国轻工业出版社，1987）。随着对抗病毒、抗肿瘤、治疗艾滋病药物研究的深入，对天然胞苷的需求量也日益增加，人们期望得到廉价的、能大规模生产胞苷的工艺方法。利用微生物的变异菌株直接发酵大量生产核苷是现代微生物学的杰出成果。相对于其他方法，此类方法具有条件简单、周期短、易控制、产率高、产量大和成本低等突出优点。国外在20世纪90年代中期才有关于胞苷可以经发酵法大规模生产的报道，而我国有关发酵法生产胞苷的研究尚属空白。随着对胞苷需求量的不断增加，发酵法生产胞苷的研究也日益得到更广泛的重视(乔宾福.微生物产生核苷和核酸[J].工业微生物,1998,28(1):2)。在微生物发酵代谢过程中，胞苷作为产物会被释放到培养基中，为了验证微生物生产胞苷的能力，需要测定培养基中胞苷的含量。目前胞苷测定的常用方法主要包括纸层析法和高效液相色谱法。纸层析法检测胞苷精度不高，而且所用的有机溶剂如丙酮等，一般有挥发性、并有一定毒性。高效液相色谱法能坚持微量胞苷，精密度和准确性很高，但仪器昂贵、操作和维护繁琐。因此，寻求简便、快速、准确和应用广泛的胞苷分析法倍受重视。采用高通量方法筛选胞苷高产菌株，即可提高工作效率，降低成本，又能大幅度地提高筛选速度。开发一种简便、快速、准确的方法检测发酵液中的胞苷含量，对于高通量筛选生产胞苷的菌株进行胞苷生产具有重要意义。
技术实现思路
为了克服筛选胞苷高产菌株的常规方法存在的工作量大、周期长和成本高等问题，本专利技术提供了一种基于深孔板的微型化培养与基于酶标仪微量化检测的高通量筛选方法。高通量筛选胞苷高产菌株的方法如下：（1）挑取胞苷生产菌的单菌落，接种于装有液体种子培养基的深孔板I中，盖上深孔板盖子，于30-40℃、300-800rpm摇床培养8-14h；（2）将深孔板I孔中的种子液对应接种到装有发酵培养基的深孔板II中，30-40℃、300-800rpm摇床培养8-48h；（3）将深孔板II放置于孔板离心机，5000-10000×g离心5-30min，以微量化梯度稀释法将发酵液上清稀释；（4）在酶标板的微孔中加入稀释的发酵液上清、缓冲液和适量的胞苷脱氨酶，以不加胞苷脱氨酶的实验为空白对照，于30-40℃温浴反应10-40min；（5）反应结束后立即加入反应液A和反应液B，且反应液A和B的加入顺序为反应液A在前，B在后，然后于30-40℃温浴反应20-50min；（6）步骤（5）反应结束后，采用酶标仪测定反应液的吸光度，根据胞苷标准曲线和发酵液上清的稀释倍数计算胞苷产量；（7）根据胞苷检测结果，选择对应的菌株进行摇瓶复筛，获得胞苷高产菌株，其中，所述反应液A包含氢氧化钠20-30g/L、水杨酸45-75g/L和亚硝基铁氰化钠1-3g/L，反应液B包含次氯酸钠40-60ml/L，步骤（5）反应结束后产生的蓝色物质的检测波长为695-700nm。在另一优选例中，所述反应液A包含苯酚15-30ml/L和亚硝基铁氰化钠0.8-3g/L，反应液B为包含氢氧化钠10-15g/L和次氯酸钠20-40ml/L，步骤（5）反应结束后产生的蓝色物质的检测波长为625-630nm。在另一优选例中，所述胞苷生产菌的单菌落为自然界含菌样品或通过物理化学等诱变方法获得的突变株。在另一优选例中，所述的深孔培养板为96孔深孔板，每个孔的体积是3mL，但是每孔中加入0.5-2.5mL的培养基。在另一优选例中，所述溶液种子培养基为：酵母粉2-10g/L，蛋白胨5-15g/L，氯化钠5-15g/L，pH7.0、121℃灭菌20min。在另一优选例中，所述发酵培养基为：葡萄糖10g/L，Na2HPO4·12H2O8.96g/L，KH2PO41.5g/L，NaCl2.5g/L，尿素2g/L，L-色氨酸0.05g/L，1000×微量元素1mL，MgSO4·7H200.49g/L，CaCl20.011g/L，其中，所述1000×微量元素组分为：MnCl21g/L，ZnCl21.7g/L，CuCl2·2H2O0.43g/L，CoCl2·6H2O0.6g/L，FeCl38.125g/L，Na2MoO4·2H2O0.6g/L，所述各组分灭菌条件为：葡萄糖110℃灭菌20min，尿素和色氨酸过滤除菌，其它组分121℃灭菌20min。在另一优选例中，所述的上清液中不能含有菌体，稀释后的上清液与所述缓冲液混合均匀，稀释后的上清液中胞苷的浓度为0.01-10mM。在另一优选例中，所述酶反应所用的缓冲液为Tris-HCl缓冲液、磷酸二氢钾缓冲液、磷酸钠缓冲液和HEPES缓冲液之中的一种，所述缓冲液的pH为7.0-8.0，浓度为0.01-0.1M。在另一优选例中，所述胞苷脱氨酶来源于枯草芽孢杆菌或大肠杆菌，反应时加入1-20U胞苷脱氨酶。在另一优选例中，所述步骤（4）发酵上清液与缓冲液的体积比为1:1-4，和/或所述步骤（5）反应液A与B的体积比为1:1-4。在另一优选例中，所述检测样本中胞苷含量与所述发酵培养基中的胞苷标准曲线的建立同时进行。胞苷脱氨酶酶活的定义：在指定的温度和pH条件下，每分钟转化1μmol胞苷释放产生氨所需的酶量，为一个酶活单位（U）。本专利技术的检测方法，可以简单、快速、准确地检测发酵液中胞苷含量，克服现有技术中设备昂贵，操作繁琐，测量耗时等不足。应理解，在本专利技术范围内中，本专利技术的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。本专利技术提供的高通量筛选胞苷高产菌株的方法如下：（1）挑取胞苷生产菌的单菌落，接种于装有液体种子培养基的深孔板I中，盖上深孔板盖子，于30-40℃、300-800rpm摇床培养8-14h；（2）将深孔板I孔中的种子液对应接种到装有发酵培养基的深孔板II中，30-40℃、300-800rpm摇床培养8-48h；（3）将深孔板II放置于孔板离心机，5000-10000×g离心5-30min，以微量化梯度稀释法将发酵液上清稀释；（4）在酶标板的微孔中加入稀释的发酵液上清、缓冲液和适量的胞苷脱氨酶，以不加胞苷脱氨酶的实验为空白对照，于30-40℃温浴反应10-40min；（5）反应结束后立即加入反应液本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种胞苷高产微生物菌株的高通量筛选方法，其特征在于按如下的步骤进行： （1）挑取胞苷生产菌的单菌落，接种于装有液体种子培养基的深孔板I中，盖上深孔板盖子，于30‑40℃、300‑800 rpm摇床培养8‑14 h；（2）将深孔板I孔中的种子液对应接种到装有发酵培养基的深孔板II中，30‑40℃、300‑800 rpm摇床培养8‑48 h；（3）将深孔板II放置于孔板离心机，5000‑10000×g离心5‑30 min，以微量化梯度稀释法将发酵液上清稀释；（4）在酶标板的微孔中加入稀释的发酵液上清、缓冲液和适量的胞苷脱氨酶，以不加胞苷脱氨酶的实验为空白对照，于30‑40℃温浴反应10‑40 min；（5）反应结束后立即加入反应液A和反应液B，且反应液A和B的加入顺序为反应液A在前，B在后，然后于30‑40℃温浴反应20‑50 min；（6）步骤（5）反应结束后，采用酶标仪测定反应液的吸光度，根据胞苷标准曲线和发酵液上清的稀释倍数计算胞苷产量；（7）根据胞苷检测结果，选择对应的菌株进行摇瓶复筛，获得胞苷高产菌株，其中，所述反应液A包含：氢氧化钠20‑30 g/L、水杨酸45‑75 g/L和亚硝基铁氰化钠1‑3 g/L；反应液B包含：次氯酸钠40‑60 ml/L，步骤（5）反应结束后产生的蓝色物质的检测波长为695‑700 nm，或所述反应液A包含苯酚15‑30 ml/L和亚硝基铁氰化钠0.8‑3 g/L，反应液B为包含氢氧化钠10‑15 g/L和次氯酸钠20‑40 ml/L，步骤（5）反应结束后产生的蓝色物质的检测波长为625‑630 nm。...

【技术特征摘要】
1.一种胞苷高产微生物菌株的高通量筛选方法，其特征在于按如下的步骤进行：
（1）挑取胞苷生产菌的单菌落，接种于装有液体种子培养基的深孔板I中，盖上深孔板盖子，于30-40℃、300-800rpm摇床培养8-14h；
（2）将深孔板I孔中的种子液对应接种到装有发酵培养基的深孔板II中，30-40℃、300-800rpm摇床培养8-48h；
（3）将深孔板II放置于孔板离心机，5000-10000×g离心5-30min，以微量化梯度稀释法将发酵液上清稀释；
（4）在酶标板的微孔中加入稀释的发酵液上清、缓冲液和适量的胞苷脱氨酶，以不加胞苷脱氨酶的实验为空白对照，于30-40℃温浴反应10-40min；
（5）反应结束后立即加入反应液A和反应液B，且反应液A和B的加入顺序为反应液A在前，B在后，然后于30-40℃温浴反应20-50min；
（6）步骤（5）反应结束后，采用酶标仪测定反应液的吸光度，根据胞苷标准曲线和发酵液上清的稀释倍数计算胞苷产量；
（7）根据胞苷检测结果，选择对应的菌株进行摇瓶复筛，获得胞苷高产菌株，
其中，所述反应液A包含：氢氧化钠20-30g/L、水杨酸45-75g/L和亚硝基铁氰化钠1-3g/L；反应液B包含：次氯酸钠40-60ml/L，步骤（5）反应结束后产生的蓝色物质的检测波长为695-700nm，或
所述反应液A包含苯酚15-30ml/L和亚硝基铁氰化钠0.8-3g/L，反应液B为包含氢氧化钠10-15g/L和次氯酸钠20-40ml/L，步骤（5）反应结束后产生的蓝色物质的检测波长为625-630nm。
2.如权利要求1所述的筛选方法，其特征在于所述胞苷生产菌的单菌落为自然界含菌样品或通过物理化学等诱变方法获得的突变株。
3.如权利要求1所述的筛选方法，其特征在于所述的深孔培养板为96孔深孔板，每个孔的体积是3mL，但是每孔中加入0.5-2....

【专利技术属性】
技术研发人员：张大伟，董会娜，刘永飞，李宁，
申请(专利权)人：中国科学院天津工业生物技术研究所，
类型：发明
国别省市：天津;12