一种金霉素高产菌株的高通量筛选方法技术

本发明专利技术公开了一种金霉素高产菌株的高通量筛选方法，属于代谢工程技术领域。本发明专利技术通过5种平板培养基上金色链霉菌生长以及产抗量比较，选择了最佳培养基，为出发菌种提供了保障。本发明专利技术通过金霉素与Sm3+的显色反应以及金霉素与盐酸共热的比色法两种初筛方法相比较，选择较为简单且准确的显色反应作为初筛方法。验证了硝酸钐显色反应作为初筛手段的重复性和准确度。

High throughput screening methods for aureomycin producing strains

The invention discloses a high-throughput screening method of chlortetracycline producing strain, which belongs to the technical field of metabolic engineering. By comparing the growth and yield of Streptomyces on 5 kinds of plate culture, the optimal medium is selected, which provides the guarantee for the starting strain. The color reaction of chlortetracycline and Sm3+ and chlortetracycline with hydrochloric acid colorimetric method of two screening methods of comparison, the color reaction of choose the simple and accurate method for screening. The repeatability and accuracy of the reaction of samarium nitrate as the primary screening method were verified.

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种筛选高产量金霉素诱变菌株的方法，属于微生物生产

技术介绍
金霉素(Chorotetracycline，即CTC)属于四环素类的一种广谱抗生素。金霉素能够抑菌、促生长、饲料利用率高、在肌体内残留量低。其生产技术已经较为成熟，生产成本也较低，成为目前饲料工业中用量最大的抑菌促生长剂。目前国内工厂金霉素的产率还较低(效价在18000μg/mL左右)，因此提高金霉素的产率很有必要。金霉素是由金色链霉菌(Streptomyces aureofaciens)发酵得到的次级代谢产物，其产量合成性状受多基因决定，代谢网络复杂。影响金霉素发酵过程的因素也很多，如种子的质量、培养基的组成、工艺条件以及发酵过程的代谢控制等。目前微生物育种技术已经从诱变、推理、重组技术发展到代谢工程、系统生物学和异源生物合成等方法。但传统诱变育种仍具有诸多优势。如不需要知道生物遗传背景、代谢模型，只需要获得有效突变库和定向筛选。高通量筛选与常规诱变结合，适用于以提高次级代谢产物产量为目标的工业生产菌株选育，尽可能减少漏筛现象。现有的金霉素菌株的筛选，一般是采用摇瓶发酵后用HPLC方法进行检测，存在培养周期长、检测所需时间长、检测方法繁琐等缺陷。
技术实现思路
为了解决上述问题，本专利技术提供了一种金霉素高产菌株的高效筛选方法。本专利技术方法结合了常压室温等离子体(ARTP)、酶标仪检测和高通量筛选技术，提高金霉素高产菌株的筛选效率。所述出发菌株金色链霉菌(Streptomyces aureofaciens)是由齐鲁制药(内蒙古)有限公司提供的工业生产菌株。本专利技术的金霉素高产菌株的高效筛选方法，主要包括步骤如下：(1)将待筛选的金色链霉菌菌悬液涂布在固体平板培养基上，待孢子成熟后挑选接种于装有种子培养液的96浅孔板中培养；(2)将96浅孔板中得到的种子液平行转接至装有发酵培养液的48孔板中发酵培养；(3)发酵结束后，离心取菌体，吸取上清液稀释至金霉素浓度为0～20mg/L，然后取稀释液100μL添加到提前加入40μL Tris-HCl缓冲溶液和60μL Sm(NO)3溶液的96孔板中，震荡混匀，8min后显色完全，酶标仪测定各浓度的OD405值，根据y＝0.0112x-0.009，R2＝0.99905(其中，x为金霉素浓度浓度(μg/mL)，y为OD405nm)计算得到金霉素浓度，进而根据稀释倍数换算得到发酵液的金霉素浓度，即得到产金霉素相对较高的菌株。在本专利技术的一种实施方式中，所述步骤(1)的固体平板培养基上的培养是在34℃培养4d。在本专利技术的一种实施方式中，所述步骤(1)的固体平板培养基配方(g/L)：蔗糖20g，进口酵母粉0.5g，KH2PO40.8g，琼脂18g。在本专利技术的一种实施方式中，所述步骤(1)的种子培养液(g/L)：蔗糖30g，进口酵母粉5g，MgSO40.5g，(NH4)2SO43g，NaCl 4g，KH2PO41g，CaCO30.2g。在本专利技术的一种实施方式中，所述步骤(1)的96浅孔板中培养是在750r/min、30～32℃摇床培养23～25h。在本专利技术的一种实施方式中，所述步骤(2)的发酵培养液(g/L)：蔗糖30g，MgSO40.5g，CaCO30.33g，柠檬酸2.55g，(NH4)2SO43g，1mL混合液(0.3％CuSO4·5H2O、0.5％ZnSO4·7H2O、0.25％MnSO4`4H2O)。在本专利技术的一种实施方式中，所述步骤(2)的发酵培养是将种子液以8％(v/v)的接种量转接至48孔板中，于750r/min、30～31℃发酵培养96～110h。在本专利技术的一种实施方式中，所述步骤(3)的离心是在4000r/min离心15min。在本专利技术的一种实施方式中，所述待筛选的金色链霉菌菌悬液，是将金色链霉菌进行诱变后得到的。在本专利技术的一种实施方式中，所述诱变，可以是物理诱变或者化学诱变，比如常压室温等离子体(ARTP)诱变、紫外诱变、甲基磺酸乙酯(EMS)诱变、亚硝基胍(NTG)诱变、硫酸二乙酯(DES)诱变等等。在本专利技术的一种实施方式中，所述步骤(1)96浅孔板中种子培养液添加量为180μL/孔。在本专利技术的一种实施方式中，所述步骤(2)48孔板中发酵培养液的添加量为1000μL/孔。在本专利技术的一种实施方式中，所述Tris-HCl缓冲溶液的pH为6.7，Sm(NO)3溶液的浓度为5×10-4mol/L。本专利技术的有益效果：本专利技术建立了一种新型的结合了金霉素显色反应和高通量筛选的方法。本专利技术研究了金霉素5种能够生长并可以检测到金霉素的平板培养基的生长和产抗量情况，得到了最佳平板培养及配方，有效提高了孢子生长速度，有效提高了后续筛选效率。同时，本专利技术通过对显色反应试剂等进行优化，得到了线性关系好的检测方法，有效提高了筛选的效率和准确性，防止了提取效果不佳导致的筛选准确性不足的问题。具体实施方式金霉素的测定：高效液相色谱(HPLC)仪器：Agilent 1260高效液相色谱仪(配紫外可见检测器、示差折光检测器和工作站)，色谱条件：色谱柱：ZORBAX LEclipse Lus Plus C18流动相：28％N-N二甲基甲酰胺+2％2mol/LH3PO4+70％去离子水流速：1mL/min柱温：35℃进样量：10μL紫外检测器波长：365nm(检测金霉素)样品制备：称取发酵液1g于试管中，用0.01mol/LHCl定容至50mL，超声5min，0.22μL无机系滤膜过滤后，进行高效液相色谱分析。致死率的计算：其中A表示空白对照平板上的菌落形成单位个数，B表示经过诱变处理后平板上的菌落形成单位个数。培养基：固体平板培养基1号(g/L)：蔗糖20g，进口酵母粉0.5g，KH2PO40.8g，琼脂18g。固体平板培养基2号(g/L)：可溶性淀粉20g，进口酵母粉0.5g，KH2PO40.8g，琼脂18g。固体平板培养基3号(g/L)：葡萄糖20g，进口酵母粉0.5g，KH2PO40.8g，琼脂18g。固体平板培养基4号(g/L)：甘油20g，进口酵母粉0.5g，KH2PO40.8g，琼脂18g。固体平板培养基5号(g/L)：面粉20g，进口酵母粉0.5g，KH2PO40.8g，琼脂18g。种子培养基(g/L)：蔗糖30g，进口酵母粉5g，MgSO40.5g，(NH4)2SO43g，NaCl 4g，KH2PO41g，CaCO30.2g。孔板发酵培养基(g/L)：蔗糖30g，MgSO40.5g，CaCO30.33g，柠檬酸2.55g，(NH4)2SO43g，1mL混合液(0.3％CuSO4·5H2O、0.5％ZnSO4·7H2O、0.25％MnSO4`4H2O)。实施例1：最佳平板培养基选择配制五中不同配方的斜平板培养基，将稀释后的无菌金色链霉菌菌悬液涂布于固体斜面培养基上。观察金色链霉菌在平板培养基上的生长情况，并检测其产抗量。结果发现固体平板培养基1号上菌株能快速生长，孢子生长良好，而且平板培养基颜色不会对后续单克隆挑选仪挑菌造成干扰。其他培养基，要么菌株生长较慢，要么平板培养基颜色对于后续单克隆挑选仪挑菌造成干扰。实施例2：ARTP诱变出发菌株斜面菌种本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种金霉素高产菌株的高效筛选方法，其特征在于，所述方法主要包括步骤如下：(1)将待筛选的金色链霉菌菌悬液涂布在固体平板培养基上，待孢子成熟后挑选接种于装有种子培养液的96浅孔板中培养；(2)将96浅孔板中得到的种子液平行转接至装有发酵培养液的48孔板中发酵培养；(3)发酵结束后，离心取菌体，吸取上清液稀释至金霉素浓度为0～20mg/L，然后取稀释液100μL添加到提前加入40μL Tris‑HCl缓冲溶液和60μL Sm(NO)3溶液的96孔板中，震荡混匀，8min后显色完全，酶标仪测定各浓度的OD405值，根据y＝0.0112x‑0.009(其中，x为金霉素浓度浓度(μg/mL)，y为OD405nm)计算得到金霉素浓度，进而根据稀释倍数换算得到发酵液的金霉素浓度，即得到产金霉素相对较高的菌株。

【技术特征摘要】
1.一种金霉素高产菌株的高效筛选方法，其特征在于，所述方法主要包括步骤如下：(1)将待筛选的金色链霉菌菌悬液涂布在固体平板培养基上，待孢子成熟后挑选接种于装有种子培养液的96浅孔板中培养；(2)将96浅孔板中得到的种子液平行转接至装有发酵培养液的48孔板中发酵培养；(3)发酵结束后，离心取菌体，吸取上清液稀释至金霉素浓度为0～20mg/L，然后取稀释液100μL添加到提前加入40μL Tris-HCl缓冲溶液和60μL Sm(NO)3溶液的96孔板中，震荡混匀，8min后显色完全，酶标仪测定各浓度的OD405值，根据y＝0.0112x-0.009(其中，x为金霉素浓度浓度(μg/mL)，y为OD405nm)计算得到金霉素浓度，进而根据稀释倍数换算得到发酵液的金霉素浓度，即得到产金霉素相对较高的菌株。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(1)的固体平板培养基上的培养是在34℃培养4d。3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(1)的固体平板培养基配方(g/L)：蔗糖20g，进口酵母粉0.5g，KH2PO4 0.8g，琼脂18g。4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(1)的种子培养液(g/L)：蔗糖30g，进口酵母...

【专利技术属性】
技术研发人员：周景文，陈坚，曹晓梅，堵国成，曾伟主，
申请(专利权)人：江南大学，
类型：发明
国别省市：江苏;32