一种耐强酸乳酸菌菌种的选育方法技术

本发明专利技术公开了一种耐强酸乳酸菌菌种的选育方法，首先，通过利用化学诱变剂，如亚硝基胍，诱变普通益生乳酸菌，开发出较大规模的乳酸菌突变群体作为新的乳酸菌遗传种质资源库，从中筛选出在乳酸菌培养基MRS上能快速生长、形态规则、特征明显的突变菌株，然后，从上述筛选出的突变菌株中进一步筛选出经人工胃液处理一定时间后仍能快速繁殖的菌株，即为选育出的耐强酸、新的优质益生乳酸菌菌株。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种耐强酸乳酸菌菌种的选育方法，具体涉及通过化学诱变开发突变群体选育新的优质益生乳酸菌，属于微生物遗传育种与发酵工程

技术介绍
人体胃肠道消化系统里存在多种菌群，有有益的、有害的以及中性的，在正常情况下这些菌群存在一种自然平衡。但是，现代饮食，生活、工作高压力以及病理条件下，有害菌群的数量升高，中性菌群产生对人体有害物质，变成有害菌群，从而导致人体结肠及消化系统菌群自然平衡失去平衡，易受病原菌的侵染，人体处于亚健康或病理状态。补充有益菌群（益生菌）有促于恢复人体自然平衡：维持胃肠道菌群平衡、保持胃肠正常功能、促进胃肠消化系统健康及提高人体免疫能力等。乳酸菌，如嗜酸乳杆菌 (Lactobacillus acidophilus)及嗜热乳酸链球菌(Streptococcus thermophilus)就是其中的一大类有益菌群。以它们为代表推出了不同系列不同类型含乳酸菌的益生菌产品。但是，通常国内外含乳酸菌的益生菌产品中乳酸菌活菌数少、活性低，尤其，食用后经过极强酸性环境的消化系统器官胃（pH3.0以下）后，存活的乳酸菌更是很少，益生菌产品食用后很难达到乳酸菌的预期功能，严重阻碍了益生乳酸菌产业发展。主要可通过2方面来解决上述难题：（1）选育活性高、耐强酸性环境、易于高密度培养的优质乳酸菌菌种；（2）研究高活性保持的乳酸菌包埋技术与活性益生乳酸菌产品加工技术。其中，优质菌种最为关键。而目前，乳酸菌的选育主要通过建立菌种库、辐射诱变及基因工程改良等手段来选育优质乳酸菌菌种。建立较大规模的菌种资源库耗时，成本高，并且不一定能收集到所需的优质菌种资源。基因工程改良菌主要用于工业等方面的特定用途。辐射诱变是一种物理诱变，诱变剂主要包括紫外线、X-射线、γ-射线，快速中子等，在诱变微生物菌种中较为常用，但选育出的优质益生菌种仍非常有限。还有另外一类诱变---化学诱变，诱变剂主要是碱基类似物、烷化剂等，在植物上得到了较广泛应用，但在微生物上少有应用。本专利技术采用化学诱变的方法来开发出较大规模的乳酸菌突变群体，作为新的乳酸菌遗传种质资源库，不存在生物安全风险，且遗传稳定，用于筛选任意性状的优质乳酸菌菌种，满足各种特征产品生产的需求；最终利用开发的突变群体选育出新的、耐强酸的优质乳酸菌菌种。本专利技术主要利用现有的普通益生乳酸菌，通过化学诱变的方法开发出较大规模的乳酸菌突变群体，从中筛选出在乳酸菌培养基MRS上能快速生长、形态规则、特征明显的菌株，然后，从上述筛选出的菌种中进一步筛选出经人工胃液处理一定时间后仍能快速繁殖的菌株，从而选育出耐强酸的、新的优质乳酸菌菌株。开发的乳酸菌突变群体是新的乳酸菌遗传种质资源库，没有生物安全风险，遗传稳定，从中可以根据各种特征产品需求筛选任意性状的优质乳酸菌菌种，为解决乳酸菌产业中的菌种瓶颈问题提供新的遗传种质资源。
技术实现思路
目的：为解决现有技术的不足，本专利技术提供了一种耐强酸乳酸菌菌种的选育方法，利用化学诱变的方法开发出较大规模的乳酸菌突变群体，然后通过高通量微生物筛选技术选育出优质耐强酸乳酸菌菌株，同时化学诱变的菌株不存在生物安全风险，遗传稳定。首先，通过利用化学诱变剂如亚硝基胍诱变普通益生乳酸菌，开发出较大规模的乳酸菌突变群体作为新的乳酸菌遗传种质资源库，从中筛选出在乳酸菌培养基MRS上能快速生长、形态规则、特征明显的菌株，然后，从上述筛选出的菌种中进一步筛选出经人工胃液处理一定时间后仍能快速繁殖的菌株，即为选育出的耐强酸、新的优质乳酸菌菌株。技术方案：为解决上述技术问题，本专利技术采用的技术方案为：一种耐强酸乳酸菌菌种的选育方法，以亚硝基胍作诱变剂为例，其步骤为：（1）化学诱变剂溶液配制先用少量二甲基亚砜（DMSO）溶解一定量的亚硝基胍，再用0.1M的灭菌磷酸缓冲液（pH7.0）配制成1.0g/L的亚硝基胍母液。（2）人工胃液制备将0.2g NaCl和0.35g胃蛋白酶溶于适量蒸馏水中，用HCl调节pH值至2.0，定容至100ml；然后，用0.22µm的微孔滤膜过滤灭菌后备用。（3）培养基制备MRS液体培养基：10g/L蛋白胨、10g/L牛肉膏、5g/L酵母粉、20g/L葡萄糖、5g/L无水乙酸钠、1ml/L吐温-80、2g/L柠檬酸二胺、2g/L磷酸氢二钾、0.58g/L硫酸镁、0.25g/L硫酸锰，用蒸馏水溶解，调节pH 6.6-6.8，并定容；高压1×105Pa灭菌20min。MRS平板培养基：在MRS液体培养基基础上添加20.0g/L琼脂，高压1×105Pa灭菌20 min。溴甲酚紫-碳酸钙平板培养基： 在MRS液体培养基基础上添加20g/L碳酸钙、1.4ml/L 1.6%溴甲酚紫及20.0g/L琼脂，高压1×105Pa灭菌20min。（4）菌种活化与培养所用乳酸菌菌株来自于中国科学院微生物研究所；菌种划线接种于MRS平板培养基上，于37℃暗中活化24h；然后，从MRS平板培养基上挑选一个单菌落，接种于5ml MRS液体培养基中，于37℃连续培养24-48h，再按3%的接种量接种于MRS液体培养基中，于37℃连续培养12-16h得菌液。（5）菌种诱变及突变群体的开发在无菌离心管中分别吸取上述培养的菌液2.5ml，加入一定量的亚硝基胍母液和灭菌磷酸缓冲液配制成总体积为5.0ml，亚硝基胍最终浓度分别为0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.6及0.8g/L，将离心管置于温度为37℃、转速为150r/min的摇床上处理30min；5000r/min离心10min，弃去上清液，用灭菌磷酸缓冲液洗涤菌体2-3次，最后加入等体积的灭菌磷酸缓冲液悬浮菌体，适当稀释，得亚硝基胍处理过的菌液；化学诱变剂诱变剂量的确定：取0.1ml菌液涂布于溴甲酚紫-碳酸钙平板，37℃恒温培养，进行菌落计数，计算致死率；以致死率为70-95%的处理浓度（0.2-0.4g/L）作为以后的亚硝基胍诱变剂量；将上述0.2、0.3、0.4 g/L亚硝基胍处理过的菌液涂布于MRS平板培养基上于37℃培养24h，然后挑选1000-2000单菌落接种于液体培养基中，于37℃培养24h，每个单菌落的培养液都为突变单体(新的遗传种质)，所有每个处理的新种质一起组成突变群体（新的种质资源库），共3个突变群体；添加20%的灭菌甘油，于-80℃长期保存；将上述0.2-0.4g/L亚硝基胍处理的菌液涂布于MRS平板培养基上于37℃培养24h，然后每个处理挑选1000-2000单菌落接种于液体培养基中，于37℃培养24h，每个单菌落的培养液都为突变单体(新的遗传种质)，所有每个处理的新种质一起组成突变群体（新的种质资源库），共3个突变群体；添加20%的灭菌甘油，于-80℃长期保存。（6）快速生长的新乳酸菌菌株筛选将上述突变单体在MRS平板培养基上划线，于37℃培养24h，挑选出形态规则、菌落明显大于其它菌落的菌落，即为新的、快速生长的乳酸菌菌种。（7）新的耐强酸乳酸菌的选育从-80℃保存的突变群体中找到对应的上述筛选出的快速生长的乳酸菌菌种，液体培养12-16h；无菌条件下取5ml菌液离心，菌体用4ml无菌生理盐水悬浮、洗涤后离心，再用4ml 10mM的PBS 缓冲液本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种耐强酸乳酸菌菌种的选育方法，首先，通过利用化学诱变剂诱变普通益生乳酸菌，开发出较大规模的乳酸菌突变群体作为新的乳酸菌遗传种质资源库，从中筛选出在乳酸菌培养基MRS上能快速生长、形态规则、特征明显的突变菌株，然后，从上述筛选出的突变菌株中进一步筛选出经人工胃液处理一定时间后仍能快速繁殖的菌株，即为选育出的耐强酸、新的优质益生乳酸菌菌株。

【技术特征摘要】
1.一种耐强酸乳酸菌菌种的选育方法，首先，通过利用化学诱变剂诱变普通益生乳酸菌，开发出较大规模的乳酸菌突变群体作为新的乳酸菌遗传种质资源库，从中筛选出在乳酸菌培养基MRS上能快速生长、形态规则、特征明显的突变菌株，然后，从上述筛选出的突变菌株中进一步筛选出经人工胃液处理一定时间后仍能快速繁殖的菌株，即为选育出的耐强酸、新的优质益生乳酸菌菌株。2.根据权利要求1所述的耐强酸乳酸菌菌种的选育方法，其特征在于：所述化学诱变剂为碱基类似物及烷化剂。3.根据权利要求1所述的耐强酸乳酸菌菌种的选育方法，其特征在于：所述化学诱变剂选自亚硝基胍或甲基磺酸乙酯。4.根据权利要求1所述的耐强酸乳酸菌菌种的选育方法，以诱变剂亚硝基胍为例，具体包括以下步骤：（1）化学诱变剂溶液配制先用二甲基亚砜DMSO溶解一定量的亚硝基胍，再用0.1M的灭菌磷酸缓冲液（pH7.0）配制成1.0g/L的亚硝基胍母液；（2）人工胃液制备将0.2g NaCl和0.35g胃蛋白酶溶于适量蒸馏水中，用HCl调节pH值至2.0，定容至100ml；然后，用0.22µm的微孔滤膜过滤灭菌后备用；（3）培养基制备MRS液体培养基：10g/L蛋白胨、10g/L牛肉膏、5g/L酵母粉、20g/L葡萄糖、5g/L无水乙酸钠、1ml/L吐温-80、2g/L柠檬酸二胺、2g/L磷酸氢二钾、0.58g/L硫酸镁、0.25g/L硫酸锰，用蒸馏水溶解，调节pH 6.6-6.8，并定容；高压1×105Pa灭菌20min；MRS平板培养基：在MRS液体培养基基础上添加20.0g/L琼脂，高压灭菌20 min；（4）菌种活化与培养乳酸菌菌种划线接种于MRS平板培养基上，于37℃暗中活化24h；然后，从MRS平板培养基上挑选一个单菌落，接种于5ml MRS液体培养基中，于37℃连续培养24-48h，再按3%的接种量接种于MRS液体培养基中，于37℃连续培养12-16h得活...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘世名，
申请(专利权)人：苏州健世星生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏;32