本发明专利技术公开了一种提高吉他霉素生产菌对正丙醇耐受性的方法。以吉他霉素生产菌为出发菌株，包子悬液添加1.5%的正丙醇，微波诱变，经初筛、复筛，得到对正丙醇具有较强耐受性的菌种。本发明专利技术设备简单，操作方便，辐射损伤轻，安全，能稳定提高发酵生产水平。
【技术实现步骤摘要】
本方明涉及，属于发酵
技术介绍
吉他霉素为大环内酯类抗生素，具有广谱抗菌作用。对大多数革兰阳性菌的抗菌活性略差，部分耐红霉素的金黄色葡萄球菌仍对吉他霉素敏感。吉他霉素对白喉杆菌、破伤风杆菌、淋病奈瑟菌、百日咳杆菌、立克次体属和沙眼衣原体也有相当活性。吉他霉素可以口服、也可以注射。临床应用优点是对大多数耐红霉素或耐青霉素的金葡菌仍有效，还可用于革兰阳性菌所致的皮肤软组织感染、呼吸道感染、链球菌咽峡炎、猩红热、白喉、军团菌病、百日咳等，以及淋病、非淋病性尿道炎、痤疮等。吉他霉素在甲醇、乙醇、丙酮、三氯甲烷、乙醚中极易溶解，在水中极微溶解，在石油醚中不溶。在抗生素生物合成中，前体物质是菌体用来构成抗生素分子而自身又没有显著改变的物质。前体除直接参与抗生素合成外，在一定条件下还控制菌体合成抗生素的方向和增加抗生素的产量。抗生素生物合成所需的前体物质有的是菌体本身能够合成的；有的是菌体本身不能合成或合成的很少，需从外界加入的。前体物质在使用过程中，要注意在培养基中的浓度，因不少前体物质对抗生素产生菌具有一定的毒性。一般采取分次滴加的方式加入前体物质，并控制在一定浓度。在吉他霉素发酵过程中正丙醇一部分是用作合成吉他霉素内酯，因而对吉他霉素的合成显刺激作用，还有一部分是消耗于其他代谢途径和损失。因而加入正丙醇作为生物合成的前体物质，可增加吉他霉素的产量，但是，在发酵前期加入正丙醇会干扰菌丝的生长，从而降低抗生素的合成，外源前体是在发酵液中的残留正丙醇，会使生产菌中毒，不利于抗生素的合成。但是前体不足也不行。
技术实现思路
本专利技术的技术方案是通过提高吉他霉素对正丙醇的耐受性，从而提高吉他霉素的产量。本专利技术的目的是提供。本专利技术通过添加正丙醇，并进行微波诱变，增加吉他霉素对正丙醇的耐受性，从而提高吉他霉素产量的方法，其包括以下步骤: (1)以吉他霉素生产菌为出发菌株，将吉他霉素生产菌制备成斜面菌种，在温度28°c，湿度30%?50%培养9天。(2)将培养好的斜面菌种在无菌条件下加入0.85%的生理盐水40ml洗下孢子，将洗下的孢子倒入带有玻璃珠的无菌三角瓶中，然后放摇床上220r/min的旋转式摇瓶机上震摇5分钟，使孢子活化和分散，再用0.85%的生理盐水稀释到孢子量10X 105个/ml，然后将正丙醇按1.5%比例加入孢子液中。(3)将稀释好的孢子液吸取10ml到无菌平皿中，调微波炉功率为800W，脉冲频率为2450MHz，处理时间15秒，对孢子悬液进行辐照处理。(4)取辐照处理后的孢子液进行稀释，吸取稀释不同梯度的孢子液涂布分离培养基平板初筛，挑取单菌落至斜面培养基，然后置于28°C，湿度30%?50%的培养基中培养9天，再经过摇瓶发酵进行复筛，所得突变菌即为对正丙醇具有耐受性的吉他霉素高产菌。(5)步骤(1)、(3)、(4)斜面培养基与平板培养基相同，配方为:淀粉20g，硫酸镁lg，磷酸二氣钾lg，酵母膏6g,加纯化水定容至1000ml,调pH值至7.2,然后琼脂按照2.4%的比例分装三角瓶中。(6)步骤(2)是将步骤(1)培养好的新鲜斜面菌种，制备成孢子悬液，在摇床上进行分散。(7)步骤(2)是将摇床震摇5分钟，使孢子活化和分散，再用0.85%的生理盐水稀释到孢子量10X 105个/ml，然后将正丙醇按1.5%比例加入孢子液中。(8)通过添加正丙醇进行微波诱变提高吉他霉素对正丙醇耐受性的方法，其特征在于步骤(4)其所用的种子培养基配方:玉米淀粉15g，葡萄糖20g，黄豆饼粉20g，蛋白胨lg，酵母膏5g,氯化钠6g,磷酸二氣钾2.5g,硫酸镁lg,加自来水定容至1000ml,调pH值至7.0,然后加入3g碳酸I丐搅拌均勻，分装30ml至250ml的三角瓶中。(9)其所用的发酵培养基配方:玉米淀粉10g，黄豆饼粉20g，葡萄糖20g，丝素粉llg，氯化铵4g,磷酸二氣钾0.87g,硫酸锌3g,氯化猛0.3g,调pH值至7.0,然后加入3g碳酸?丐搅拌均勻，分装40ml至500ml的三角瓶中。(10)摇瓶复筛是将吉他霉素生产菌0.5平方厘米的种子接种到种子培养基中，种子摇瓶在培养基中培养24?26h，培养成熟的种子液按照10%的比例接入到发酵摇瓶培养基中，发酵摇瓶培养15h，补20%的正丙醇1.5ml，发酵摇瓶培养80h，放瓶测效价。种子瓶摇瓶及发酵摇瓶的培养条件为:温度28°C，湿度30%?50%，摇床转速220r/min。本专利技术的优点: 通过本方法得到的对高浓度正丙醇具有耐受性的突变吉他霉素菌种，对正丙醇耐受的浓度达到1.5%以上，提高了吉他霉素菌种对正丙醇的耐受性，在生产菌种转化率不变的情况下，吉他霉素的产量得到了提高，100L发酵罐70h达到13000u/ml以上。此方法设备简单，操作方便，辐射损伤轻，安全，能稳定提高发酵生产水平。【具体实施方式】: 下面结合实施例进一步说明本专利技术。实施例1: 诱变与筛选:将吉他霉素生产菌制备成斜面菌种，在温度28°C，湿度30%?50%培养9天；将培养好的斜面菌种在无菌条件下加入0.85%的生理盐水40ml洗下孢子，将洗下的孢子倒入带有玻璃珠的无菌三角瓶中，然后放摇床上220r/min的旋转式摇瓶机上震摇5分钟，使孢子活化和分散，再用0.85%的生理盐水稀释到孢子量10X 105个/ml，孢子液中正丙醇按1.5%比例加入，分成两份。斜面培养基与平板培养基相同，配方为:淀粉20g，硫酸镁lg，磷酸二氢钾lg，酵母膏6g，加纯化水定容至1000ml，调pH值至7.2，然后琼脂按照2.4%的比例分装至三角瓶中。对照份:取一份制备好的孢子液涂平板培养基，每个平当前第1页1 2 本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种提高吉他霉素生产菌对正丙醇耐受性的方法，其特征在于以下步骤：以吉他霉素生产菌为出发菌株，将吉他霉素生产菌制备成斜面菌种，在温度28℃，湿度30%～50%培养9天；将培养好的斜面菌种在无菌条件下加入0.85%的生理盐水40ml洗下孢子，将洗下的孢子倒入带有玻璃珠的无菌三角瓶中，然后放摇床上220r/min的旋转式摇瓶机上震摇5分钟，使孢子活化和分散，再用0.85%的生理盐水稀释到孢子量10×105个/ml,然后将正丙醇按1.5%比例加入孢子液中；将稀释好的孢子液吸取10ml到无菌平皿中，调微波炉功率为800W，脉冲频率为2450MHz,处理时间15秒，对孢子悬液进行辐照处理；取辐照处理后的孢子液进行稀释，吸取稀释不同梯度的孢子液涂布分离培养基平板初筛，挑取单菌落至斜面培养基，然后置于28℃，湿度30%～50%的培养间中培养9天，再经过摇瓶发酵进行复筛，所得突变菌即为对正丙醇具有耐受性的吉他霉素高产菌。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：沈玲霞，余洪智，于新令，
申请(专利权)人：山东方明药业集团股份有限公司，
类型：发明
国别省市：山东;37
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