本发明专利技术公开了一种L-天冬氨酸β-脱羧酶产生菌的高通量筛选方法。该方法包括如下步骤：1)采用富集培养基对样品中的微生物进行富集培养与初步分离；2)然后将平板分离得到的单菌落接种96微孔板初筛半固体培养基，初筛得到L-天冬氨酸β-脱羧酶产生菌；3)对初筛得到的菌株接种24孔板液体培养，结合纸层析法复筛得到L-天冬氨酸β-脱羧酶高产菌株；4)对复筛得到的高产菌株进行摇瓶发酵，结合氧化显色法确认酶活性。本发明专利技术方法适用于L-天冬氨酸β-脱羧酶产生菌的高通量筛选，筛选的菌株具有耐碱性能，在细胞生产过程中避免了繁琐pH值控制步骤。同时也为同类生物酶产生菌的高通量筛选提供参考。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于微生物制药领域，涉及一种L-天冬氨酸β-脱羧酶产生菌的高通量筛选方法。
技术介绍
L-天冬氨酸β-脱羧酶(Asd)，又称L-天冬氨酸1-脱羧酶，能催化脱去L-天冬氨酸的羧基，生成L-丙氨酸(L-Ala)。L-丙氨酸在医药和食品工业上的应用相当广泛，随着需求量的增加和发酵工业的发展，L-丙氨酸的生产方法由蛋白质水解提取法、发酵法发展到酶法生产，即利用L-天冬氨酸β-脱羧酶将L-天冬氨酸脱羧生成L-丙氨酸。用Asd转化生产L-Ala可分为游离细胞法和固定化细胞转化法。日本已经在1982年用卡拉胶固定Pseudomonas.dacunhae细胞用于L-Asp连续生产L-Ala。国内刘景晶等(参见高丽娟等人于2007年在《工业微生物》37(5)：54-59中发表的文章)用卡拉胶固定含有Asd活性的Pseudomonas.dacunhae细胞，在pH6.2～pH7.25范围内和底物浓度为0.4mol/L-0.5mol/L时，固定化细胞表现出最高酶活力。然而在L-丙氨酸酶法转化过程中，脱羧反应使反应液pH值不断上升，偏离了酶反应的最适pH值范围，导致细胞的酶活力降低，这对工艺过程控制和生物反应器提出更高要求。由于海洋微生物具有陆生微生物无法比拟的生态群落结构多样性和物种多样性，所以从海洋环境中筛选具有特殊耐受性质的生物酶产生菌是目前微生物领域研究的特点，本专利技术基于该理念，建立了从海洋生境中快速筛选L-天冬氨酸β-脱羧酶的高通量方法，并且筛选的菌株具有耐碱性能，在细胞生产过程中避免了繁琐pH值控制步骤。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种L-天冬氨酸β-脱羧酶产生菌的高通量筛选方法。本专利技术所提供的L-天冬氨酸β-脱羧酶产生菌的高通量筛选方法，具体而言，可包括如下步骤：1)采用富集培养基对样品中的微生物进行富集培养与初步分离；2)将步骤1)分离得到的单菌落穿刺接种微孔板初筛半固体培养基，培养后根据培养基的浑浊程度筛选L-天冬氨酸β-脱羧酶产生菌；3)将步骤2)初筛得到的菌株接种微孔板液体培养，收集菌体进行生物转化，采用纸层析法分析生成的L-丙氨酸含量，得到L-天冬氨酸β-脱羧酶高产菌株；4)将步骤3)复筛得到的高产菌株进行摇瓶发酵培养，收集菌体进行生物转化，然后氧化显色法测定L-天冬氨酸β-脱羧酶酶活性。在上述方法中，步骤1)中，所述微生物样品来自海绵、珊瑚、海底淤泥，所述富集培养基含有质量百分含量1％-2％的NaCl；步骤2)中，所述初筛半固体培养基含有质量百分含量0.05％的CaCl2；步骤3)中，所述生物转化的操作方式为：将步骤2)初筛得到的菌株接种到复筛培养基，20℃-37℃恒温培养后离心收集菌体，与生物转化液混合，混合物20℃-37℃孵育12-24小时；步骤4)中，所述生物转化的操作方式为：将步骤3)复筛得到的菌株接种到摇瓶发酵培养基，20℃-37℃恒温培养后离心收集菌体，与生物转化液混合，混合物20℃-37℃孵育12-24小时；在上述方法中，步骤1)中所述富集培养的方式为：将微生物样品用富集培养基洗涤三次，然后接种到富集培养基，温度20℃-37℃、转速100-200转/分钟振荡培养2-4天；所述富集培养基各组分的质量百分含量为：牛肉膏0.5％，蛋白胨1％，酵母粉0.2％，KH2PO40.05％,K2HPO4·H2O0.14％，NaCl1.5％，pH8.5-9.0。步骤3)中，所述复筛培养基各组分的质量百分含量为：葡萄糖3％，蛋白胨1％，酵母粉0.2％，NaCl1.5％，KH2PO40.05％,K2HPO4·H2O0.14％，MgSO4·7H2O0.03％，CaCl20.05％，pH8.5-9.0。步骤4)中，所述摇瓶发酵培养基各组分的质量百分含量为：葡萄糖3％，蛋白胨1％，酵母粉0.2％，NaCl1.5％，KH2PO40.05％,K2HPO4·H2O0.14％，MgSO4·7H2O0.03％，CaCl20.05％，pH8.5-9.0。步骤3)与步骤4)中，所述生物转化液各组分的质量百分含量为：L-天冬氨酸2％，KH2PO40.05％,K2HPO4·H2O0.14％，pH8.5-9.0。本专利技术的再一个目的是提供一种L-天冬氨酸β-脱羧酶产生菌的初筛半固体培养基。所述初筛半固体培养基各组分的质量百分含量为：L-天冬氨酸2％，葡萄糖3％，蛋白胨1％，酵母粉0.2％，NaCl1.5％，KH2PO40.05％,K2HPO4·H2O0.14％，MgSO4·7H2O0.03％，CaCl20.05％，琼脂0.8％，pH8.5-9.0；将所述初筛半固体培养基分装于96孔酶标板，制得初筛半固体培养基孔板。所述初筛半固体培养基在对耐碱L-天冬氨酸β-脱羧酶产生菌的高通量筛选中的应用也属于本专利技术的保护范围。本专利技术提供的L-天冬氨酸β-脱羧酶产生菌高通量筛选方法，可以用于快速筛选具有耐碱性能的L-天冬氨酸β-脱羧酶产生菌，以解决酶法生产L-Ala过程中pH值不断上升酶活性降低的问题，省略工艺过程不断调节pH值步骤；该高通量筛选方法填补了目前国内在该方面研究的空白，同时也为同类生物酶产生菌的高通量筛选提供参考。具体实施方式下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法；所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径购买。实施例1L-天冬氨酸β-脱羧酶产生菌的筛选一、样品中微生物的富集与分离富集培养基：牛肉膏0.5％，蛋白胨1％，酵母粉0.2％，KH2PO40.05％,K2HPO4·H2O0.14％，NaCl1.5％，pH7.0-7.2，121℃灭菌20min，冷却后备用；分离培养基平板：牛肉膏0.5％，蛋白胨1％，NaCl1.5％，琼脂2％，pH8.5-9.0，121℃灭菌20min，然后倒平皿制作分离平板，20mL/皿，冷却凝固后待用；1、采样文献报道海洋微生物具有陆生微生物无法比拟的生态群落结构多样性和物种多样性，故选取了烟台黄海海域作为采样地点，采集了海绵、珊瑚、海底淤泥等共10个样品。2、富集样品取回实验室后，将样品用100mL富集培养基洗涤三次，然后置于1000mL无菌三角瓶中，温度30℃、转速150转/分钟振荡培养3d，该步骤可将样品中的微量微生物进行富集培养。3、平板分离将富集后的菌液用无菌生理盐水十倍梯度稀释后涂布分离培养基平板，30℃培养3d，作为筛选L-天冬氨酸β-脱羧酶产生菌的菌种资源库。二、96微孔板穿刺培养初筛1、初筛培养基孔板的制备<本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种L‑天冬氨酸β‑脱羧酶产生菌的高通量筛选方法，包括如下步骤：1)采用富集培养基对样品中的微生物进行富集培养与初步分离；2)将步骤1)分离得到的单菌落穿刺接种微孔板初筛半固体培养基，培养后根据培养基的浑浊程度筛选L‑天冬氨酸β‑脱羧酶产生菌；3)将步骤2)初筛得到的菌株接种微孔板液体培养，收集菌体进行生物转化，采用纸层析法分析生成的L‑丙氨酸含量，得到L‑天冬氨酸β‑脱羧酶高产菌株；4)将步骤3)复筛得到的高产菌株进行摇瓶发酵培养，收集菌体进行生物转化，然后氧化显色法测定L‑天冬氨酸β‑脱羧酶酶活性。
【技术特征摘要】
1.一种L-天冬氨酸β-脱羧酶产生菌的高通量筛选方法，包括如下步骤：
1)采用富集培养基对样品中的微生物进行富集培养与初步分离；
2)将步骤1)分离得到的单菌落穿刺接种微孔板初筛半固体培养基，培养后根据培养基
的浑浊程度筛选L-天冬氨酸β-脱羧酶产生菌；
3)将步骤2)初筛得到的菌株接种微孔板液体培养，收集菌体进行生物转化，采用纸层
析法分析生成的L-丙氨酸含量，得到L-天冬氨酸β-脱羧酶高产菌株；
4)将步骤3)复筛得到的高产菌株进行摇瓶发酵培养，收集菌体进行生物转化，然后氧
化显色法测定L-天冬氨酸β-脱羧酶酶活性。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：
步骤1)中，所述微生物样品来自海绵、珊瑚、海底淤泥，所述富集培养基含有质量百
分含量1％-2％的NaCl；
步骤2)中，所述初筛半固体培养基含有质量百分含量0.05％的CaCl2；
步骤3)中，所述生物转化的操作方式为：将步骤2)初筛得到的菌株接种到复筛培养
基，20℃-37℃恒温培养后离心收集菌体，与生物转化液混合，混合物20℃-37℃孵育12-24
小时；
步骤4)中，所述生物转化的操作方式为：将步骤3)复筛得到的菌株接种到摇瓶发酵
培养基，20℃-37℃恒温培养后离心收集菌体，与生物转化液混合，混合物20℃-37℃孵育12-24
小时。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：步骤1)中所述富集培养的方式为：
将微生物样品用富集培养基洗涤三次，然后接种到富集培养基，温度20℃-37℃、转速100-200
转/分钟振荡培养2-4天；所述富集培养基各组分的质量百分含量为：牛肉膏0.5％，蛋白胨...
【专利技术属性】
技术研发人员：李东升，傅风华，张淑敏，杨小平，
申请(专利权)人：山东国际生物科技园发展有限公司，
类型：发明
国别省市：山东;37
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