一种L-天冬氨酸β-脱羧酶产生菌的高通量筛选方法技术

本发明专利技术公开了一种L-天冬氨酸β-脱羧酶产生菌的高通量筛选方法。该方法包括如下步骤：1)采用富集培养基对样品中的微生物进行富集培养与初步分离；2)然后将平板分离得到的单菌落接种96微孔板初筛半固体培养基，初筛得到L-天冬氨酸β-脱羧酶产生菌；3)对初筛得到的菌株接种24孔板液体培养，结合纸层析法复筛得到L-天冬氨酸β-脱羧酶高产菌株；4)对复筛得到的高产菌株进行摇瓶发酵，结合氧化显色法确认酶活性。本发明专利技术方法适用于L-天冬氨酸β-脱羧酶产生菌的高通量筛选，筛选的菌株具有耐碱性能，在细胞生产过程中避免了繁琐pH值控制步骤。同时也为同类生物酶产生菌的高通量筛选提供参考。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于微生物制药领域，涉及一种L-天冬氨酸β-脱羧酶产生菌的高通量筛选方法。
技术介绍
L-天冬氨酸β-脱羧酶(Asd)，又称L-天冬氨酸1-脱羧酶，能催化脱去L-天冬氨酸的羧基，生成L-丙氨酸(L-Ala)。L-丙氨酸在医药和食品工业上的应用相当广泛，随着需求量的增加和发酵工业的发展，L-丙氨酸的生产方法由蛋白质水解提取法、发酵法发展到酶法生产，即利用L-天冬氨酸β-脱羧酶将L-天冬氨酸脱羧生成L-丙氨酸。用Asd转化生产L-Ala可分为游离细胞法和固定化细胞转化法。日本已经在1982年用卡拉胶固定Pseudomonas.dacunhae细胞用于L-Asp连续生产L-Ala。国内刘景晶等(参见高丽娟等人于2007年在《工业微生物》37(5)：54-59中发表的文章)用卡拉胶固定含有Asd活性的Pseudomonas.dacunhae细胞，在pH6.2～pH7.25范围内和底物浓度为0.4mol/L-0.5mol/L时，固定化细胞表现出最高酶活力。然而在L-丙氨酸酶法转化过程中，本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种L‑天冬氨酸β‑脱羧酶产生菌的高通量筛选方法，包括如下步骤：1)采用富集培养基对样品中的微生物进行富集培养与初步分离；2)将步骤1)分离得到的单菌落穿刺接种微孔板初筛半固体培养基，培养后根据培养基的浑浊程度筛选L‑天冬氨酸β‑脱羧酶产生菌；3)将步骤2)初筛得到的菌株接种微孔板液体培养，收集菌体进行生物转化，采用纸层析法分析生成的L‑丙氨酸含量，得到L‑天冬氨酸β‑脱羧酶高产菌株；4)将步骤3)复筛得到的高产菌株进行摇瓶发酵培养，收集菌体进行生物转化，然后氧化显色法测定L‑天冬氨酸β‑脱羧酶酶活性。

【技术特征摘要】
1.一种L-天冬氨酸β-脱羧酶产生菌的高通量筛选方法，包括如下步骤：
1)采用富集培养基对样品中的微生物进行富集培养与初步分离；
2)将步骤1)分离得到的单菌落穿刺接种微孔板初筛半固体培养基，培养后根据培养基
的浑浊程度筛选L-天冬氨酸β-脱羧酶产生菌；
3)将步骤2)初筛得到的菌株接种微孔板液体培养，收集菌体进行生物转化，采用纸层
析法分析生成的L-丙氨酸含量，得到L-天冬氨酸β-脱羧酶高产菌株；
4)将步骤3)复筛得到的高产菌株进行摇瓶发酵培养，收集菌体进行生物转化，然后氧
化显色法测定L-天冬氨酸β-脱羧酶酶活性。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：
步骤1)中，所述微生物样品来自海绵、珊瑚、海底淤泥，所述富集培养基含有质量百
分含量1％-2％的NaCl；
步骤2)中，所述初筛半固体培养基含有质量百分含量0.05％的CaCl2；
步骤3)中，所述生物转化的操作方式为：将步骤2)初筛得到的菌株接种到复筛培养
基，20℃-37℃恒温培养后离心收集菌体，与生物转化液混合，混合物20℃-37℃孵育12-24
小时；
步骤4)中，所述生物转化的操作方式为：将步骤3)复筛得到的菌株接种到摇瓶发酵
培养基，20℃-37℃恒温培养后离心收集菌体，与生物转化液混合，混合物20℃-37℃孵育12-24
小时。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：步骤1)中所述富集培养的方式为：
将微生物样品用富集培养基洗涤三次，然后接种到富集培养基，温度20℃-37℃、转速100-200
转/分钟振荡培养2-4天；所述富集培养基各组分的质量百分含量为：牛肉膏0.5％，蛋白胨...

【专利技术属性】
技术研发人员：李东升，傅风华，张淑敏，杨小平，
申请(专利权)人：山东国际生物科技园发展有限公司，
类型：发明
国别省市：山东;37