本发明专利技术提供了一种高通量筛选耐油污微藻的方法，可以高效的筛查高通量筛选耐油污微藻。本发明专利技术利用小体积微藻培养方法，在微藻一次培养过程中，采集微藻增殖全过程数据，应用大数据分析软件Simca-P，对根据不同需要设置的不同条件组合的油-藻互作关系进行分析，通过运行软件分析获得的PCA图，能得到明确的筛选结论。本发明专利技术的方法，可以在筛选实验中，根据微藻和油污水的特征，设置足够多的实验组别：构建微藻种类、不同起始密度与油污水不同处理、不同浓度在不同培养条件下的多维度相互关系实验组，应用Simca-P软件的大数据分析能力，从而可以确定出典型条件下耐受油污的微藻。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于微藻筛选领域，具体设及一种高通量筛选耐油污微藻的方法。
技术介绍
来源于生活污水、石油泄露、溢油及石油工业化学制品等的油污，是水体富营养化 重要的有机污染源。因此，油污水处理是水质保护和治理的一个重要目标。在消减工业油污 水排放、生活污水治理等领域，将耐油微藻或可利用油污组分的微藻接种到油污水中，一方 面微藻的增殖利用可消减油污，另一方面增殖的微藻生物量可W用于开发进一步的生物质 应用。而筛选合适的微藻是一个重要的环节，其中，微藻对油污的耐受性分析是一个重要方 法。 但是，油污水是一类复杂的多源性污染物，来源于生活污水的、石油开采慢漏的、 突发性溢油的、石油化工的污染排放的、或其他生产劳动过程中排放的油污，其组分在各时 间、各案例中都可能各不相同；同时，油污染浓度的不同，也对微藻增殖造成不同影响。另 夕h自然界中的微藻种类繁多，不同种类的微藻，受复杂多样的油污染源影响时，其细胞增 殖、生理生化参数变化特征都是不同的；在不同季节、不同营养盐环境条件、不同的起始生 物量对油污染的响应差异也显著不同。 可见，在筛选耐油污微藻时，需设置油污染和微藻的多维度互作实验组，因此，筛 选和分析时，在方法学上具有显著的复杂性，常出现大量实验组W及产生复杂的数据关系， 工作量大，数据量大且关系复杂，从而易造成结论的不确定性、W及筛查范围、筛查对象局 限性。
技术实现思路
[000引本专利技术提供了一种高通量筛选耐油污微藻的方法，可W高效的筛查高通量筛选耐 油污微藻从而弥补现有技术的不足。 本专利技术的方法，包括如下的步骤： 1)首先，分别将待检测的已经纯化的单种微藻，分别加入到已添加不同浓度的待 检测油水的培养基中进行微藻的增殖培养作为耐油污检测组;并设置2-6个平行样； 2)同时，将对应微藻分别加入无油污的正常微藻培养基中，在相同条件下进行微 藻的增殖培养，作为空白对照组;设置2-6个平行样； 3)对全部微藻在相同的环境条件下进行一次培养方式的增殖培养，对微藻生物量 变化进行每天连续检测，获得各组每天的生物量变化数据； 4) 一次培养结束后，利用Simca-P计算机软件对全部数据进行主成分分析(PCA); 5)结果的判别[001引根据PCA图分析，与空白对照组明显分开的微藻为受到对应油污染影响严重的种 类，为不耐油污种类;与空白对照组不能分开或分开无显著性的，为耐油污种类。所述的微藻，指来源于淡水、海水、咸水或其他水域环境中的、已经纯化的可培养 的单细胞自养微藻或具有异养能力的微藻； 所述的油污水，指各种来源的油污染水，包括生活污水、石油工业污水来源的石油 化学品油污水、特殊劳动或生产工艺过程中排放的油污水等;或已经明确化学成分的油污 水； 所述培养基，指常用适宜微藻增殖的培养基，如f/2培养基，或在培养介质中添加 利于特异微藻正常增殖营养需求的培养基； 所述导入Simca-p软件的数据整理，指将观测的生物量数据作为X变量，实验组别 信息作为Y变量，导入Simca-p软件。 本专利技术的方法，可W在筛选实验中，根据微藻和油污水的特征，设置足够多的实验 组别:构建微藻种类、不同起始密度与油污水不同处理、不同浓度在不同培养条件下的多维 度相互关系实验组，应用Simca-p软件的大数据分析能力，从而可W确定出典型条件下耐受 油污的微藻。【附图说明】 图1:4个微藻在4种石油化学品3个浓度下的生物量变化图； 图2:微藻对不同石油化学品响应的PCA图。【具体实施方式】 在透明多孔培养板上，将待检测的不同油污水制备的油水培养基，与不同目标微 藻混合，形成油污实验组;将对应微藻接种至适宜微藻增殖的无油污微藻培养基中，作为空 白对照组，在相同的环境条件下，进行一次培养。每天检测各培养孔中68化m或对应微藻吸 收峰值处的吸光值，对微藻生物量变化进行连续跟踪。收集全部数据后，利用Simca-p计算 机软件(>12，1]1116化；!^3,5￥6(16]1)对全部数据进行主成分分析。〔4):将观测值(吸光值或对 应的生物量值)作为X变量，实验组别信息作为Y变量，导入Simca-p，选用CTR Scanning模 式，运行程序。从得到的PCA中，分析油污组与对照组之间的差异显著性:油污实验组与空白 对照组显著分开的微藻，表示该微藻受油污影响大，不耐受油污；油污实验组与空白对照 组不能分开的，表示该微藻不受油污影响，为耐油污微藻。 根据实际培养的微藻正常增殖的需要，可W将多孔培养板置换成小体积培养瓶， 则检测生物量时，可将直接读取多孔板上的吸光值改为取样检测细胞数、吸光值或其他可 表征生物量变化的定量指标。 实施例1: 1)将4种纯化培养的海洋微藻，包括:柔弱角刺藻、球等鞭金藻、东海原甲藻、剧毒 卡罗藻，正常培养至指数期;将待检测的油水样品（双酪、对苯二甲酸、对二甲苯)溶于f/2藻 类培养基中，形成浓度分别为0.1 ppm、Ippm和lOppm的油水培养基;将油水培养液与藻液按 照1:1比例分别置于24孔板中，开多成油污终浓度为0.05ppm、0.5ppm和5ppm油藻混合液，各处 理各2平行。 2)同期，将不同种微藻分别对应加至无添加油水样品的f/2培养基，作为空白对照 组，各2平行； 3)将24孔板置于溫度为18-20°C，光照为35-85皿ol/m2 · S化:D = 12h:12h)的培养 室中进行培养； 4)在一次培养过程中，每天用多功能酶标仪检测各藻液在680nm波长处吸光值变 化； 5)收集全部数据后，指将观测的生物量数据作为X变量，实验组别信息作为Y变量， 导入Simca-P软件。利用Simca-P计算机软件对全部数据进行主成分分析(PCA)。原始数据见 下表。[002引 6)结果的判别 利用Excel数据分析，获得4个微藻在4种石油化学品3个浓度下的生物量变化情况 如图1所示。从图1可见，柔弱角刺藻(Chaetoceros debilis)在不同实验浓度的巧巾石油化 学品影响下，增殖程度有差异，对于高浓度（5ppm)石油化学品增殖影响不显著，低浓度 (0.05ppm)影响下，并没有促进其增殖;而中浓度(0.5ppm)影响下，双酪促进其增殖，其他两 种石油化学品对二甲苯，对苯二甲酸对其有不同程度的抑制影响。球等鞭金藻（Isocrysis ga化ana)对于高浓度(5ppm)石油化学品增殖影响波动较大，中，低浓度(0.5ppm和0.05ppm) 影响相似，对二甲苯和对苯二甲酸对其有不同程度促进影响，而双酪有一定程度抑制增殖 影响。对于两种甲藻，东海原甲藻（Prorocentrum donghaiense)和剧毒卡罗藻 化arlodinium veneficum)对于不同浓度石油化学品影响有一定相似性:高浓度(5ppm)对 于增殖影响波动较大，而中，低浓度(0.5ppm和0.05ppm)影响相似，3种石油化学品对其增殖 都有一定抑制作用。 但是，油污与微藻之间的明确关系并不能一目了然，没有判定结论。利用Simca-P 数据分析软件得到的PCA图如图2。相对于空白对照组，同一种微藻对不同石油化学品响应 存在差异，柔弱角刺藻受对苯二甲酸影响与对照组无明显差异，而双酪、对二甲苯则影响明 显；球等鞭金藻受对二本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种高通量筛选耐油污微藻的方法，其特征在于，所述的方法，包括如下的步骤：1)首先，分别将待检测的已经纯化的单种微藻，分别加入到已添加不同浓度的待检测油水的培养基中进行增殖培养作为耐油污检测组；2)同时，将对应微藻分别加入无油污的微藻培养基中，在相同条件下进行增殖培养，作为空白对照组；3)对全部微藻在相同的环境条件下进行一次培养方式的增殖培养，对微藻生物量变化进行每天连续检测，获得各组每天的生物量变化数据；4)一次培养结束后，利用Simca‑P计算机软件对全部数据进行主成分分析(PCA)；5)结果的判别根据PCA图分析，与空白对照组明显分开的微藻为受到对应油污染影响严重的种类，为不耐油污种类；与空白对照组不能分开或分开无显著性的，为耐油污种类。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：杨小倩，周成旭，耿沙沙，叶央芳，骆其君，严小军，蒋莹，马斌，
申请(专利权)人：宁波大学，
类型：发明
国别省市：浙江;33
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