与重度少弱精子症相关的生物标志物的筛选与应用制造技术

本发明专利技术公开了一种与重度少弱精子症相关的生物标志物的筛选方法，首先利用NanoHPLC‑MS/MS质谱系统和非标记定量蛋白质组学方法对多组重度少弱精疾病的精子蛋白非编码氨基酸进行了深度的质谱分析；然后利用非限定氨基酸蛋白质修饰分析方法对质谱数据进行搜索，再经过多变量高斯混合分布聚类分析，尽可能大量的鉴定出精子蛋白组中非编码氨基酸；最后通过正常和病人精子蛋白组中非编码氨基酸的比较，得到与重度少弱精症相关的蛋白非编码氨基酸位点，从而将其作为重度少弱精症的分子标志物，为重度少弱精症提供了新的诊断和治疗靶点。

Screening and application of biomarkers related to severe oligospermia and asthenospermia

The invention discloses a screening method of less severe weak sperm disease related biomarkers, we use NanoHPLC MS/MS mass spectrometry system and non labeling quantitative proteomics method of multiple weak sperm disease less severe sperm protein non encoding amino acid for the depth of the mass spectrum analysis; and then use the non limited amino acid protein modified method for analysis of mass spectrometry data search, through the multivariate Gauss mixture distribution clustering analysis, as far as possible a large number of identified non amino acids encoding sperm protein group; finally through the comparison of non normal sperm protein encoding amino acid and the patient in the group, with less severe weak sperm protein associated with non encoding amino acid sites, and as the less severe weak molecular markers of azoospermia, provides diagnostic and therapeutic target for treatment of severe oligospermatism.

【技术实现步骤摘要】
与重度少弱精子症相关的生物标志物的筛选与应用
本专利技术涉及医学和分子诊断
，具体涉及一种与重度少弱精子症相关的生物标志物的筛选与应用。
技术介绍
不孕不育已成为全世界范围内的生殖健康问题，其中由于男性因素造成的不育大概占50％左右，且近年来呈上升的趋势。造成男性不育的主要原因是少精弱精症。根据世界卫生组织标准规定，如果a级精子数<25％，(a+b)级精子数<50％，且精子活率低于60％的话，就可诊断为弱精子症。少精子症是指精液中的精子数目低于正常具有生育能力男性的一种病症，当男性的精子在每毫升低于2千万时，就为少精子症。目前关于精子蛋白质组的研究有很多。Saraswat等利用UPLC-MS的方法在人类精子中定量了667个蛋白，并且分析出了20个健康人和弱精症患者精子中的差异蛋白(SaraswatM,JoenvaaraS,JainTetal.HumanSpermatozoaQuantitativeProteomicSignatureClassifiesNormo-andAsthenozoospermia.Molecular&cellularproteomics:MCP,16(1),57-72(2017).)。最新更新的人类精子蛋白质组共6198个蛋白(AmaralA,CastilloJ,Ramalho-SantosJ,OlivaR.Thecombinedhumanspermproteome:cellularpathwaysandimplicationsforbasicandclinicalscience.Humanreproductionupdate,20(1),40-62(2014).)。GaigaiWang等利用高分辨质谱在人类精子中鉴定出4675个蛋白(WangG,GuoY,ZhouTetal.In-depthproteomicanalysisofthehumanspermrevealscomplexproteincompositions.Journalofproteomics,79,114-122(2013).)。络氨酸磷酸化对于精子的运动、获能、超激运动等过程重要作用。Chying-ChyuanChan等通过对20组正常人和弱精症患者的精子进行蛋白质组学分析发现有12种包括TUBGCP2在内的蛋白发生了过磷酸化(ChanCC,ShuiHA,WuCHetal.MotilityandProteinPhosphorylationinHealthyandAsthenozoospermicSperm.Journalofproteomeresearch,8(11),5382-5386(2009))。非编码氨基酸包括翻译后修饰和氨基酸突变，是调控蛋白功能和结构的重要方式，因此将疾病状态下异常的或者数量变化极大的非编码氨基酸作为疾病的生物标志物，进而用于诊断疾病的进程具有重要意义。但目前还未有关于非编码氨基酸作为与重度少弱精子疾病相关的生物标志物的报道。
技术实现思路
针对上述现有技术，本专利技术的目的提供一种与重度少弱精子症相关的生物标志物的筛选与应用。本专利技术首先利用NanoHPLC-MS/MS质谱系统和非标记定量蛋白质组学方法对多组重度少弱精疾病的精子蛋白非编码氨基酸进行了深度的质谱分析；然后利用非限定氨基酸蛋白质修饰分析方法对质谱数据进行搜索，再经过多变量高斯混合分布聚类分析，尽可能大量的鉴定出精子蛋白组中非编码氨基酸；最后通过正常和病人精子蛋白组中非编码氨基酸的比较，得到与重度少弱精症相关的蛋白非编码氨基酸位点，从而将其作为重度少弱精症的分子标志物。为实现上述目的，本专利技术采用如下技术方案：本专利技术的第一方面，提供了一种与重度少弱精子症相关的生物标志物的筛选方法，包括如下步骤：(1)提取精子细胞全蛋白；(2)将精子细胞全蛋白采用凝胶电泳分离，切胶酶解，对酶解后的肽段进行脱盐，制备得到样品；(3)将步骤(2)的样品采用纳流液相色谱分离，经纳流液相色谱分离后的样品再进行质谱检测，采集质谱数据；(4)利用非限定氨基酸蛋白质修饰分析方法对质谱数据进行搜索，再经过多变量高斯混合分布聚类分析，尽可能大量的鉴定出精子蛋白组中非编码氨基酸；最后通过正常个体和重度少弱精个体精子蛋白组中非编码氨基酸的比较，得到与重度少弱精症相关的蛋白非编码氨基酸位点，即为与重度少弱精子症相关的生物标志物。步骤(1)中，提取精子细胞全蛋白采用的方法为：将精子样本采用DPBS洗涤，加入RIPA裂解液超声1～2min，置于冰上孵育30min裂解，离心，取上清。优选的，在4℃的条件下离心，离心转速为14,000g，离心时间为20min。步骤(2)中，优选的，采用10％聚丙烯酰氨凝胶电泳(SDS-PAGE)对蛋白进行分离。步骤(2)中，优选的，采用ziptip对酶解后的肽段进行脱盐。步骤(3)中，纳流液相色谱分离的色谱条件为：流动相A：含有0.1％甲酸的水，流动相B：含有0.1％甲酸的乙腈；纳流液相质谱分析系统为OrbitrapElite(ThermoScientific)洗脱条件为：0-100min，95-68％流动相A，5-32％流动相B；100-120min，68-20％流动相A，32-80％流动相B；120-150min，20％流动相A，80％流动相B；流速为300nL/min。步骤(3)中，质谱检测的条件为：350-1800m/z的全扫描，分辨率为60,000(m/z200)。二级图谱扫描时，活化时间为10ms，隔离宽度为2m/z；碎裂方式为诱导碰撞解离(collision-induceddissociation,CID)，归一化碰撞能量设定为35％，动态排出时间为90s。步骤(4)中，对质谱数据进行搜索的参数设置为：蛋白酶为胰蛋白酶，漏切位点设置为2，母离子质量偏差为10ppm，碎片离子的质量偏差为0.6Da，盲搜上限设为1000，盲搜下限设为-200，蛋白FDR为0.01；选择肽段分数>200和FDR<0.01的肽段作为WildcardSearchTM搜索到的未知修饰数据，组成质量变化的一维数据矩阵(-200Da-400Da)，再将数据按照1Da的变化范围，0.5Da为界限，分割成601个数据窗口。步骤(4)中，多变量高斯混合分布聚类分析的方法为：针对每一个数据窗口，用R语言中的mclust程序包做高斯混合分布聚类分析，根据BIC取最优值，再对每一个峰进行合并分析，然后用高斯分布拟合每一个峰，确定峰值；聚类之后的每个峰中所包含的肽段位点数据，根据位点氨基酸分布，选择分布大于5％的数据作为一类非编码氨基酸。步骤(4)中，将正常个体和重度少弱精个体的非编码氨基酸按照其检测频率的T检验(p<0.05)和比值(ratio>2)进行筛选，从而得到差异非编码氨基酸。上述筛选方法是用于获得生物标志物，且不是以获得疾病的诊断和治疗结果为目的；经上述筛选方法获得的生物标志物可用于重度少弱精子症的理论研究或者新药物的开发。本专利技术的第二方面，提供根据上述筛选方法筛选得到的与重度少弱精子症相关的生物标志物，所述生物标志物包括但不限于：AKAP3蛋白208位发生+79.96685质量偏移的丝氨酸(标记为S+7本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种与重度少弱精子症相关的生物标志物的筛选方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)提取精子细胞全蛋白；(2)将精子细胞全蛋白采用凝胶电泳分离，切胶酶解，对酶解后的肽段进行脱盐，制备得到样品；(3)将步骤(2)的样品采用纳流液相色谱分离，经纳流液相色谱分离后的样品再进行质谱检测，采集质谱数据；(4)利用非限定氨基酸蛋白质修饰分析方法对质谱数据进行搜索，再经过多变量高斯混合分布聚类分析，尽可能大量的鉴定出精子蛋白组中非编码氨基酸；最后通过正常个体和重度少弱精个体精子蛋白组中非编码氨基酸的比较，得到与重度少弱精症相关的蛋白非编码氨基酸位点，即为诊断和/或治疗重度少弱精子疾病的生物标志物。

【技术特征摘要】
1.一种与重度少弱精子症相关的生物标志物的筛选方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)提取精子细胞全蛋白；(2)将精子细胞全蛋白采用凝胶电泳分离，切胶酶解，对酶解后的肽段进行脱盐，制备得到样品；(3)将步骤(2)的样品采用纳流液相色谱分离，经纳流液相色谱分离后的样品再进行质谱检测，采集质谱数据；(4)利用非限定氨基酸蛋白质修饰分析方法对质谱数据进行搜索，再经过多变量高斯混合分布聚类分析，尽可能大量的鉴定出精子蛋白组中非编码氨基酸；最后通过正常个体和重度少弱精个体精子蛋白组中非编码氨基酸的比较，得到与重度少弱精症相关的蛋白非编码氨基酸位点，即为诊断和/或治疗重度少弱精子疾病的生物标志物。2.如权利要求1所述的筛选方法，其特征在于，步骤(1)中，提取精子细胞全蛋白采用的方法为：将精子样本采用DPBS洗涤，加入RIPA裂解液超声1～2min，置于冰上孵育30min裂解，离心，取上清。3.如权利要求2所述的筛选方法，其特征在于，在4℃的条件下离心，离心转速为14,000g，离心时间为20min。4.如权利要求1所述的筛选方法，其特征在于，步骤(2)中，采用10％聚丙烯酰氨凝胶电泳对蛋白进行分离。5.如权利要求1所述的筛选方法，其特征在于，步骤(2)中，采用ziptip对酶解后的肽段进行脱盐。6.如权利要求1所述的筛选方法，其特征在于，步骤(3)中，纳流液相色谱分离的色谱条件为：流动相A：含有0.1％甲酸的水，流动相B：含有0.1％甲酸的乙腈；洗脱条件为：0-100min，95-68％流动相A，5-32％流动相B；1...

【专利技术属性】
技术研发人员：杨静华，陈新骏，吕鑫，赵涵，李翠玲，毕白斌，巩晶，王凤芹，孙胜楠，王兴元，陈子江，杨静鸣，
申请(专利权)人：山东大学，南京山诺生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：山东,37