一组甲基化基因及其检测方法技术

本发明专利技术公开了一种一组甲基化基因及其检测方法，所述一组甲基化基因为p16、DLEC1、CDH1、DAPK及RUNX3基因，DNA基因序列分别为：SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5，在肺癌病人血浆游离DNA样品中，上述基因特定CpG位点发生高度甲基化。本发明专利技术的这些基因是肺癌生物标志物；可作为设计肺癌诊断试剂的基础，适用于医院肺癌早期辅助检测，可对肺癌高危人群做早期风险评估。

【技术实现步骤摘要】
一组甲基化基因及其检测方法
本专利技术属于医学检测
，尤其涉及一种一组甲基化基因及其检测方法。
技术介绍
肺癌作为一种常见的恶性肿瘤，近几十年内其发病、死亡率于全球总体上呈上升趋势，在恶性肿瘤中往往处于首位。许多研究都表明，肺癌的发生发展是一个多基因、多因素及多阶段的复杂过程，其大致涉及两大机制，一是表观遗传学层面，二是遗传学层面。其中表观遗传学在肺癌发生发展过程中起着举足轻重的作用，而DNA甲基化则是表观遗传学最重要的一种修饰方式。DNA甲基化是真核生物体内的一种内源性修饰过程，一般是指由于DNA甲基转移酶(DNMTs)的催化，生物体把S-腺苷甲硫氨酸(SAM-CH3)中的甲基(-CH3)连接到胞嘧啶核苷酸(Cytosine，C)的第5位残基上，从而使胞嘧啶(C)甲基化为5'-甲基胞嘧啶(5'-Methylcytosine，5'-mC)的过程。胞嘧啶核苷酸(C)能与鸟嘌呤核苷酸(G)通过磷酸二酯键共价结合为二核苷酸(即CpG)。正常健康人基因组中约80％左右的CpG都分散分布在基因组内，且都处于甲基化状态，比如重复序列。另有一小部分CpG则呈高度密集状态，通常当胞嘧啶(C)与鸟嘌呤(G)的总和超过4种碱基总和的50％左右时，我们把这种富含CpG结构的DNA片段称为CpG岛。通常CpG岛位于5'端的基因启动子、第一外显子以及3'末端区域，且一般处于非甲基化状态。肿瘤DNA异常甲基化一般有两种形式，即局部相关基因CpG岛的甲基化水平升高以及CpG岛以外的整体基因组DNA的甲基化水平降低。整体基因组DNA的低甲基化水平可能激活原来保持沉默的基因，尤其是ras及fos等原癌基因；而局部相关基因启动子CpG岛的异常高甲基化则可能导致某些基因(尤其是抑癌基因)的转录沉默。而近来一系列研究也已经证实，肿瘤发生发展中某些抑癌基因5'端CpG岛(尤其是启动子区域)会发生异常甲基化，从而使该基因转录受到抑制，这是抑癌基因表达失活的关键。同时研究发现，许多基因的异常甲基化都与肿瘤的发生发展有关，而目前的研究主要集中在4类基因，即抑癌基因(包括p16INK4a、p15INK4b、p14ARF、APC等)、DNA修复基因(MLH1与MGMT等)、代谢酶基因(GSTP1)与肿瘤分子侵袭转移相关基因(DAPK、CDH1等)。这些基因涉及细胞周期调控、细胞间信号转导、细胞凋亡、肿瘤的侵袭转移及DNA损伤修复等过程。目前针对肺癌的早期诊断依旧相当困难，其早期诊断率低。影像学检查(如常规CT检查)很难检出1cm以下的肿块；而传统的支气管刷检法及痰脱落细胞学法的检测结果也差强人意；作为肺癌临床诊断金标准的病理组织学诊断，一般都需获取组织活检标本，有创，伤害大，对于那些不能耐受手术检查或者不具备相应检查条件的患者往往并不适用，且通过病理检测得到的结果早已失去了早期诊断的意义；肿瘤标志物(尤其是血浆或血清中的分子标志物)的检测来进行肺癌的早期筛查，具有特异性强、敏感度高、标本易获取以及无创等优点，且便于观察预后。近些年，有关肺癌肿瘤标志物研究以及检测方法层出不穷，如“液体活检”技术。此技术就是一种直接从血浆或其他体液中检测循环肿瘤细胞或游离DNA(cfDNA)的技术，有望把肺癌的早期诊断推向一个新的高度。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种一组甲基化基因及其检测方法，旨在解决目前针对肺癌的早期诊断依旧相当困难，其早期诊断率低，影像学方法(如常规CT检查)很难发现1cm以下的肿块；而传统的支气管刷检法及痰脱落细胞学法的检测结果也差强人意；作为肺癌临床诊断金标准的病理组织学诊断，一般都需获取组织活检标本，有创，伤害大，对于那些不能耐受手术检查或者不具备相应检查条件的患者往往并不适用，且通过病理检测得到的结果早已失去了早期诊断的意义的问题。本专利技术是这样实现的，一组甲基化基因，所述一组甲基化基因包括p16、DLEC1、CDH1、DAPK及RUNX3基因；DNA基因序列分别为：SEQIDNO：1、SEQIDNO：2、SEQIDNO：3、SEQIDNO：4、SEQIDNO：5。本专利技术另一目的在于提供一种一组甲基化基因的检测方法，所述一组甲基化基因的检测方法包括以下步骤：1)抽取受检者外周血20ml，并将其血浆分离；提取上述血浆中的cfDNA,并对其进行亚硫酸盐修饰；2)分别设计p16、DLEC1、CDH1、DAPK及RUNX3基因的外引物、甲基化引物及非甲基化引物，对上述亚硫酸盐修饰过的cfDNA中的p16、DLEC1、CDH1、DAPK及RUNX3基因进行巢氏甲基化特异性PCR两轮扩增；3)将上述PCR扩增产物行琼脂糖凝胶电泳，并在凝胶成像系统下观察结果，并行测序验证；4)对上述观察结果中p16、DLEC1、CDH1、DAPK及RUNX3基因甲基化情况进行联合检测评估。进一步，所述一组甲基化基因的检测方法具体包括：步骤一，血浆样本的分离及保存：抽取受检者外周血20ml，并立即置于4℃冰箱短时间保存1h，备用；把分别装有10ml左右外周血样本的两只抗凝管置于低速离心机，然后2500rpm，4℃离心，15min，使样品分血浆、白细胞、红细胞三层；用移液枪小心轻柔的吸出抗凝管中最上层2/3的血浆，置于新的15ml离心管中；然后把取出的血浆再次2500rpm，4℃离心，10min；并把上清液分装到几管1.5ml离心管中，标记好后置于-80℃保存；步骤二，血浆cfDNA的提取及其浓度测定；步骤三：cfDNA的琼脂糖凝胶电泳：制备1％的琼脂糖凝胶；并且等琼脂糖溶液温度降至65℃时加入花青素；制备胶板；将冷却到65℃左右的琼脂糖凝胶溶液倒入制胶槽内，室温下静置，直至完全凝固；将凝固后的胶板放入已倒入1×TAE缓冲液的电泳槽中浸润，然后开始点样；取4μl血浆cfDNA与2μl的6×loadingDye混合，然后依据样品顺序逐孔点样；在100V电压下电泳20分钟，然后取出凝胶，置于凝胶成像系统下观察结果；步骤四，血浆cfDNA的亚硫酸氢盐修饰；步骤五，血浆cfDNA中p16、DLEC1、CDH1、DAPK及RUNX3基因的巢式甲基化特异性PCR扩增；步骤六：PCR产物的琼脂糖凝胶电泳；步骤七：判断标准:把只有单独的甲基化M引物扩增成功或者是甲基化M引物及非甲基化U引物都扩增成功判断为此基因有阳性异常甲基化，而把只有单独的非甲基化引物U扩增成功判断为此基因阴性无异常甲基化；M代表甲基化，U代表非甲基化；步骤八：PCR结果的验证，包括：(1)PCR产物的选取：取出p16、DLEC1、CDH1、DAPK及RUNX3基因在血浆cfDNA中的nMSP第二轮PCR扩增产物；首先在这5个基因的所有M扩增成功的阳性样本里分别随机选取几个p16阳性样本、几个DLEC1阳性样本、几个CDH1阳性样本、几个DAPK阳性样本及几个RUNX3阳性样本，并挑出这些被选取的阳性样本的甲基化引物M扩增产物，用以验证其是否为真的阳性；其次在这5个基因的所有只有U扩增成功的阴性样本里分别随机选取几个p16阴性样本、几个DLEC1阴性样本、几个CDH1阴性样本、几个DAPK阴性样本及几个RUNX3阴性样本，并挑出这些被选取的阴性样本的非甲基化引物U扩增产物，用以验证其是否为真的阴性；(2)本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种一组甲基化基因，其特征在于，所述一组甲基化基因包括p16、DLEC1、CDH1、DAPK及RUNX3基因；DNA基因序列分别为：SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5。

【技术特征摘要】
1.一种一组甲基化基因，其特征在于，所述一组甲基化基因包括p16、DLEC1、CDH1、DAPK及RUNX3基因；DNA基因序列分别为：SEQIDNO：1、SEQIDNO：2、SEQIDNO：3、SEQIDNO：4、SEQIDNO：5。2.一种如权利要求1所述一组甲基化基因的检测方法，其特征在于，所述一组甲基化基因的检测方法包括以下步骤：1)抽取受检者外周血20ml，并将其血浆分离；提取上述血浆中的cfDNA,并对其进行亚硫酸盐修饰；2)分别设计p16、DLEC1、CDH1、DAPK及RUNX3基因的外引物、甲基化引物及非甲基化引物，对上述亚硫酸盐修饰过的cfDNA中的p16、DLEC1、CDH1、DAPK及RUNX3基因进行巢氏甲基化特异性PCR两轮扩增；3)将上述PCR扩增产物行琼脂糖凝胶电泳，并在凝胶成像系统下观察结果，并行测序验证；4)对上述观察结果中p16、DLEC1、CDH1、DAPK及RUNX3基因甲基化情况进行联合检测评估。3.如权利要求2所述的一组甲基化基因的检测方法，其特征在于，所述一组甲基化基因的检测方法具体包括：步骤一，血浆样本的分离及保存：抽取受检者外周血20ml，并立即置于4℃冰箱短时间保存1h，备用；把分别装有10ml左右外周血样本的两只抗凝管置于低速离心机，然后2500rpm，4℃离心，15min，使样品分血浆、白细胞、红细胞三层；用移液枪小心轻柔的吸出抗凝管中最上层2/3的血浆，置于新的15ml离心管中；然后把取出的血浆再次2500rpm，4℃离心，10min；并把上清液分装到几管1.5ml离心管中，标记好后置于-80℃保存；步骤二，血浆cfDNA的提取及其浓度测定；步骤三：cfDNA的琼脂糖凝胶电泳：制备1％的琼脂糖凝胶；并且等琼脂糖溶液温度降至65℃时加入花青素；制备胶板；将冷却到65℃左右的琼脂糖凝胶溶液倒入制胶槽内，室温下静置，直至完全凝固；将凝固后的胶板放入已倒入1×TAE缓冲液的电泳槽中浸润，然后开始点样；取4μl血浆cfDNA与2μl的6×loadingDye混合，然后依据样品顺序逐孔点样；在100V电压下电泳20分钟，然后取出凝胶，置于凝胶成像系统下观察结果；步骤四，血浆cfDNA的亚硫酸氢盐修饰；步骤五，血浆cfDNA中p16、DLEC1、CDH1、DAPK及RUNX3基因的巢式甲基化特异性PCR扩增；步骤六：PCR产物的琼脂糖凝胶电泳；步骤七：判断标准:把只有单独的甲基化M引物扩增成功或者是甲基化M引物及非甲基化U引物都扩增成功判断为此基因有阳性异常甲基化，而把只有单独的非甲基化引物U扩增成功判断为此基因阴性无异常甲基化；M代表甲基化，U代表非甲基化；步骤八：PCR结果的验证，包括：(1)PCR产物的选取：取出p16、DLEC1、CDH1、DAPK及RUNX3基因在血浆cfDNA中的nMSP第二轮PCR扩增产物；首先在这5个基因的所有M扩增成功的阳性样本里分别随机选取几个p16阳性样本、几个DLEC1阳性样本、几个CDH1阳性样本、几个DAPK阳性样本及几个RUNX3阳性样本，并挑出这些被选取的阳性样本的甲基化引物M扩增产物，用以验证其是否为真的阳性；其次在这5个基因的所有只有U扩增成功的阴性样本里分别随机选取几个p16阴性样本、几个DLEC1阴性样本、几个CDH1阴性样本、几个DAPK阴性样本及几个RUNX3阴性样本，并挑出这些被选取的阴性样本的非甲基化引物U扩增产物，用以验证其是否为真的阴性；(2)PCR产物的连接和转化；(3)阳性克隆子的筛选；(4)测序:挑取阳性克隆子对应编号平板上的菌落，沾在600μl的LB-Amp液体培养基中，再置于摇床上，200rpm，37℃，过夜，进行扩大培养；作甲基化测序；(5)验证：运用Bioanalysis软件，结合NCBI上下载的参考序列，与目的基因p16、DLEC1、CDH1、DAPK及RUNX3各几个被选取的阳性样本中甲基化引物M扩增产物的阳性克隆子...

【专利技术属性】
技术研发人员：孔祥阳，武超群，黄新伟，付玉，郭丽琼，
申请(专利权)人：昆明理工大学，
类型：发明
国别省市：云南,53