用于鉴定猕猴的多重PCR引物和方法以及它们在鉴定猕猴中的应用技术

本发明专利技术属于生物检测领域，提供了一种用于鉴定猕猴的多重PCR引物和方法以及它们在鉴定猕猴中的应用，所述多重PCR引物包括如SEQ ID No：1和SEQ ID No：2所示的引物对1；本发明专利技术还提供了一种利用多重PCR鉴定猕猴的方法，所述方法包括：(1)提取待测样品的总DNA；(2)采用多重PCR引物对步骤(1)中提取的总DNA进行PCR扩增；(3)取步骤(2)中得到的产物做琼脂糖凝胶电泳检测；本发明专利技术的目的在于克服现有技术中通过形态学特征对猕猴物种进行测定的局限性，或是以常规方法对粪便中DNA进行测定来确定物种的方法的耗时耗力且花费较大的问题，提供一种简便快捷且经济的用于鉴定猕猴的多重PCR引物和鉴定猕猴的方法，以及它们在鉴定猕猴中的应用。

【技术实现步骤摘要】
用于鉴定猕猴的多重PCR引物和方法以及它们在鉴定猕猴中的应用
本专利技术涉及生物检测领域，具体地，涉及一种用于鉴定猕猴的多重PCR引物及使用所述多重PCR引物鉴定猕猴的方法，以及它们在鉴定猕猴中的应用。
技术介绍
灵长目(Primates)是动物界最高等的类群，非人类灵长类因其复杂的社会结构、行为模式和多样的生存方式成为我们这个星球上重要的自然资源。它们大多栖息于亚洲、南美洲和非洲的热带、亚热带和温带的山林中，多为树栖，少数生活于地面，杂食性，具有复杂的社会行为。全世界共记载有657个灵长类种(亚种)，据2015年版《中国哺乳动物多样性及地理分布》记载，我国目前共有灵长目动物3科26种。灵长类动物不仅是生物学与医药研究重要的实验动物，而且也是热带、亚热带地区生态环境保护的旗舰物种，具有重要的科研价值。一般来说，对灵长类动物威胁最大的是人类的活动，而盗猎和栖息地丧失是威胁灵长类生存最主要的因素。在我国分布的26种灵长类动物中，除新近发现并被命名的缅甸金丝猴(Rhinopithecusstrykeri)、达旺猴(Macacamunzala)及白颊猕猴(Macacaleucogenys)三种以外，所有灵长类动物都已被列为国家I级或II级重点保护动物。作为《中国生物多样性保护战略与行动计划》(2011-2030年)优先确定的生物多样性保护优先区域，位于我国东部经济发达地区的华东华中丘陵平原区被赋予了生物多样性保护更多的重任。该区内被确定为重点地区的黄山-怀玉山区、大别山区及武夷山区则是我国灵长类动物在华东地区的重要栖息地，主要分布有猴科(Cercopithecidae)的两个物种，即猕猴(Macacamulatta)和藏酋猴(Macacathibetana)。其中，猕猴在我国分布最为广泛，华东、华南诸省(区)广东、广西、云南、贵州、福建、安徽、江西、湖南、湖北、四川皆有分布。因猕猴的适应性强，容易被捕获并驯养，成为违法盗猎行为的最主要捕猎对象。在野生动物的保护及管理工作中，基于分类学的准确物种鉴定是首要的前提。物种鉴定的结果往往是森林公安、工商、边检等行政执法部门开展野生动物资源保护与管理工作的基础。传统的形态学分类方法一直是灵长类动物鉴定的常用方法，但形态学分类方法固有的一些缺陷也给物种鉴定工作带来了困难，比如表型可塑性和遗传可变性、生物性别和发育阶段限制等。尤其是近年来在实际鉴定工作中发现，一些来源疑似猴科动物的样品(如毛发、残肢、骨骼、皮张及粪便等)，它们均非完整个体且样品量较小，往往较难从形态学上加以识别。这反映出在现实工作中，单纯基于形态学特征的物种鉴定方法已难以满足现代动物分类学及保护事业发展的巨大需求。因此，提供一种无需DNA的测序、序列比对等繁琐步骤，同时对样品来源无限制，且可仅通过一次PCR扩增即可快速有效地实现对猕猴物种的精确测定的多重PCR引物是本专利技术亟需解决的问题。
技术实现思路
针对上述现有技术，本专利技术的目的在于克服现有技术中通过形态学特征对猕猴物种进行测定的局限性，或是以常规方法对粪便中DNA进行测定来确定物种的方法的耗时耗力且花费较大的问题，提供一种简便快捷且经济的用于鉴定猕猴的多重PCR引物和鉴定猕猴的方法，以及它们在鉴定猕猴中的应用。为了实现上述目的，本专利技术提供了一种用于鉴定猕猴(Macacamulatta)的多重PCR引物，所述多重PCR引物包括如SEQIDNo：1和SEQIDNo：2所示的引物对1。本专利技术还提供了一种利用多重PCR鉴定猕猴(Macacamulatta)的方法，所述方法包括：(1)提取待测样品的总DNA；(2)采用多重PCR引物对步骤(1)中提取的总DNA进行PCR扩增；(3)取步骤(2)中得到的产物做琼脂糖凝胶电泳检测；其中，所述多重PCR引物为权利要求1中所述的多重PCR引物，其中，在步骤(3)所得的琼脂糖凝胶电泳图中，若含有步骤(2)得到的产物的泳道中出现条带，则判断所述待测样品为来自猕猴的样品，若含有步骤(2)得到的产物的泳道中不出现条带，则判断所述待测样品不是来自猕猴的样品；其中，出现的条带中所含有的DNA片段的长度为560-570bp。本专利技术还提供了多重PCR引物在鉴定猕猴(Macacamulatta)中的应用。通过上述技术方案，本专利技术基于位点特异性PCR方法实现对猕猴的物种特异性分子鉴定；本方法通过利用1对猕猴物种特异性引物，仅需1次PCR反应，通过对电泳图谱条带的判读即可鉴定样品是否来自猕猴，具有耗时较少(﹤3小时)、操作简便及成本低廉的优点，并可广泛适用于以粪便样品为研究对象的种群遗传学研究领域，极大丰富了猕猴的保护生物学研究手段，具有较大的推广价值。本专利技术的其他特征和优点将在随后的具体实施方式部分予以详细说明。附图说明附图是用来提供对本专利技术的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与下面的具体实施方式一起用于解释本专利技术，但并不构成对本专利技术的限制。在附图中：图1是实施例1-5和对比例1-9的扩增产物的PCR扩增条带的电泳图谱；其中，泳道1来自梅花鹿肌肉样品、泳道2来自猕猴肌肉样品、泳道3来自野猪肌肉样品、泳道4来自黑麂肌肉样品、泳道5来自猕猴肌肉样品、泳道6来自藏酋猴肌肉样品、泳道7来自猕猴肌肉样品、泳道8来自云豹肌肉样品、泳道9来自原麝肌肉样品、泳道10来自猕猴肌肉样品、泳道11来自白鹇肌肉样品、泳道12来自绞花林蛇肌肉样品、泳道13来自锈链腹链蛇肌肉样品、泳道14来自猕猴肌肉样品、泳道15来自武夷湍蛙、泳道C来自双蒸水样品。具体实施方式以下对本专利技术的具体实施方式进行详细说明。应当理解的是，此处所描述的具体实施方式仅用于说明和解释本专利技术，并不用于限制本专利技术。本专利技术还提供了一种利用多重PCR鉴定猕猴(Macacamulatta)的方法，所述方法包括：(1)提取待测样品的总DNA；(2)采用多重PCR引物对步骤(1)中提取的总DNA进行PCR扩增；(3)取步骤(2)中得到的产物做琼脂糖凝胶电泳检测；其中，所述多重PCR引物为权利要求1中所述的多重PCR引物，其中，在步骤(3)所得的琼脂糖凝胶电泳图中，若含有步骤(2)得到的产物的泳道中出现条带，则判断所述待测样品为来自猕猴的样品，若含有步骤(2)得到的产物的泳道中不出现条带，则判断所述待测样品不是来自猕猴的样品；其中，出现的条带中所含有的DNA片段的长度为560-570bp。在本专利技术中，为了达到更好的PCR扩增效果，使得得到的琼脂糖凝胶电泳图更清晰可见，便于更好地确定实验结果，以30μL的PCR扩增体系为基准，每条引物的用量为0.9-1.1μL，DNA模板的用量为45-55ng。所述PCR扩增过程中的退火过程可以为本领域所常规使用的退火方式及退火参数，在本专利技术中，为了得到更好的扩增效果，所述PCR扩增过程的退火温度为55-60℃，退火时间为25-40s。本专利技术还提供了多重PCR引物在鉴定猕猴(Macacamulatta)中的应用。以下将通过实施例对本专利技术进行详细描述。需要阐明的是，实验中使用的样品皆来自安徽师范大学保护遗传学实验室，-80℃保存，具体信息见表1。PCR反应试剂为10×buffer、Taq酶、Mg2+、dNTP(全式金，北京)，蛋白酶K(Merck，美国)，DNA纯化试剂盒(天本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于鉴定猕猴(Macaca mulatta)的多重PCR引物，其特征在于，所述多重PCR引物包括如SEQ ID No：1和SEQ ID No：2所示的引物对1。

【技术特征摘要】
1.一种用于鉴定猕猴(Macacamulatta)的多重PCR引物，其特征在于，所述多重PCR引物包括如SEQIDNo：1和SEQIDNo：2所示的引物对1。2.一种利用多重PCR鉴定猕猴(Macacamulatta)的方法，其特征在于，所述方法包括：(1)提取待测样品的总DNA；(2)采用多重PCR引物对步骤(1)中提取的总DNA进行PCR扩增；(3)取步骤(2)中得到的产物做琼脂糖凝胶电泳检测；其中，所述多重PCR引物为权利要求1中所述的多重PCR引物；其中，在步骤(3)所得的琼脂糖凝胶电泳图中，若含有步骤(2)得到的产物的泳道中出现条带，则判断所述待测样品为来自猕猴的...

【专利技术属性】
技术研发人员：吴孝兵，孙龙，孙洪计，晏鹏，
申请(专利权)人：安徽师范大学，
类型：发明
国别省市：安徽,34