一种乙肝表面抗原免疫逃逸突变基因检测膜条以及PCR引物制造技术

本发明专利技术涉及一种可用于医学上诊断乙肝表面抗原8种常见基因突变的杂交膜条，具体涉及一种乙肝表面抗原免疫逃逸突变基因检测膜条以及用于扩增待检样品基因片段的PCR引物，所述基因检测膜条包括基底以及在所述基底上固定有正常对照探针和特异性的突变检测探针，共包括用于检测9个基因突变位点的10条突变检测探针和8条正常对照探针，所述9个基因突变位点分别为C358A、A376T、T377G、A378C、G388G389A390/A388A389C390、C428T、A431C、G433A和G434C。本发明专利技术的基因检测膜条进行检测，能直接对待检者的基因型进行确诊，具有准确性高、特异性强等优点。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种可用于医学上诊断乙肝表面抗原8种常见基因突变的杂交膜条，具体涉及一种乙肝表面抗原免疫逃逸突变基因检测膜条以及用于扩增待检样品基因片段的PCR引物。
技术介绍
乙型肝炎病毒(hepatitisBvirus,HBV)感染可引发一系列验证的肝脏疾病，包括急性和慢性肝炎，肝硬化和原发性肝癌。据世界卫生组织（WorldHealthOrganization，WHO）估计，全世界有超过2.4亿人感染乙肝病毒，主要发生在发展中国家。而且每年死于乙型肝炎病毒感染的多达78.6万人。乙肝表面抗原是乙肝病毒的主要诊断标志，其氨基酸序列包含一个高度亲水区，位于氨基酸的99-169区域，主要亲水区中还有一个“a”抗原决定簇区域，该决定簇是HBsAg刺激B细胞产生抗体以及表面抗原免疫学诊断的最重要的表位。目前的研究已经表明，“a”抗原决定簇区域的突变可以改变抗体对表面抗原蛋白的识别，氨基酸替换导致构象改变，进而影响中和抗体结合使得用针对野生毒株“a”抗原决定簇的诊断试剂盒产生假阴性结果。在过去的十年中，乙肝病毒表面抗原逃逸突变已经从一个未知流行率的学术现象转变为疾病诊断过程中要考虑的一个因素，而且已有文献报道“a”抗原决定簇区域的突变体在某些人群中比例可高达66%。乙肝病毒表面抗原突变能够突破疫苗和免疫球蛋白保护，引发病毒的母婴传播；同时该类突变体能够突破免疫抑制病人（如肝移植病人）的免疫球蛋白保护。因此，HBV突变体的检测对这两类人群有着重要的意义。本专利技术一共对美国国家生物技术信息(NCBI)网站上的11221条非冗余的乙型肝炎病毒序列(包含从A到H8个基因型)进行了分析(数据截止2012年)，首次揭示了全球范围内乙肝表面抗原免疫逃逸突变在8种基因型中不同的分布频率。经过分析，发现了8个与乙肝表面抗原免疫试剂盒检测失败以及突破疫苗和免疫球蛋白保护的高频率氨基酸突变，分别是P120T，T126S，Q129H，G130N，S143L，D144A，G145A/R。这些突变均在一个或者多个基因型中发现，且突变频率不低于1%，这为我们大规模开展乙肝表面抗原免疫逃逸突变诊断提供了理论依据。目前，在基因突变检测中的传统方法主要包括突变特异性扩增系统(ARMS)，单链构象多态性分析(PCR-SSP)，DNA直接测序法，荧光定量PCR法，变性高效液相色谱法以及DNA芯片法等，这些方法由于存在不能定性，或者耗时费力、所需设备耗材昂贵以及难以同时对不同基因的多个突变位点进行检测等缺点，导致不适用于在临床大规模推广应用。
技术实现思路
本专利技术的目的是针对现有技术中的不足，提供一种乙肝表面抗原免疫逃逸突变基因检测膜条，该基因检测膜条可以检测9个基因突变位点共9种突变类型，应用基因检测膜条进行检测，能直接对待检者的基因型进行确诊，具有准确性高、特异性强等优点。本专利技术的另一专利技术目的是，提供用于扩增待检样品基因片段的PCR引物，该PCR引物能满足9个基因突变位点在同一个反应体系和反应条件下扩增，引物特异性好，准确率高，与探针的结合性能好，扩增速率快，对于临床检测具有很强的临床指导意义。本专利技术的目的通过以下技术方案实现：一种乙肝表面抗原免疫逃逸突变基因检测膜条，包括基底以及在所述基底上固定有正常对照探针和特异性的突变检测探针，共包括用于检测9个基因突变位点的10条突变检测探针和8条正常对照探针，所述9个基因突变位点分别为C358A、A376T、T377G、A378C、G388G389A390/A388A389C390、C428T、A431C、G433A和G434C。本专利技术的基因检测膜条可以检测9个基因突变位点共9种突变类型，应用基因检测膜条进行检测，能直接对待检者的基因型进行确诊，具有准确性高、特异性强等优点。优选的，所述10条突变检测探针分别为：358BM、358CM、376M、377M、387M、388M、428M、431M、433M和434M，所述10条突变检测探针的3’端或5’端均带有氨基标记。更为优选的，所述突变检测探针的具体序列分别为：358BMGCACCGGAACATGCA358CMCACGGGAACATGCAAG376MCTGCACATCTCCTGCTTGCACGTCTCCTGCT377MTGCACGAGTCCTGCT387MCTGCTCACGGAACCTC388MCTGCTCAAAACACCTCT428MCAAAACCTWTGGACGG431MCTACGGCCGGAAACT433MCGGACAGAAACTGCAC434MCGGACGCAAACTGC。优选的，所述8条正常对照探针分别为：358BN、358CN、376N、377N、387N、388N、428N和431/433/434N，所述8条正常对照探针的3’端或5’端均带有氨基标记。更为优选的，所述正常对照探针的具体序列分别为：358BNCACCGGACCATGCA358CNACGGGACCATGCAAG376NCTGCACAACTCCTGCTTGCACGACTCCTGCT377NTGCACGATTCCTGCTTGCACGACTCCTGC387NCTGCTCAAGGAACCTCT388NCTGCTCAAGGAACCTCT428NCAAAACCTWCGGACG431/433/434NTCGGACGGAAACT。优选的，所述检测膜条上的探针阵列具体从左至右包括3行6列依次排列，共18个探针位点，第一行的探针排列为：358BN、358BM、358CN、358CM、376N和376M；第二行的探针排列为：377N、377M、387N、387M、388N和388M；第三行的探针排列为：428N、428M、431/433/434N、431M、433M和434M。一种乙肝表面抗原免疫逃逸突变基因检测膜条的制备方法，包括如下步骤：a.用打印机在基底上打印位点阵列，并标明相应位点的探针名称；b.用EDAC溶液泡膜30分钟，以活化尼龙膜表面的羧基；c.分别用探针稀释液将18条探针稀释至5μmol/L；d.按尼龙膜条上打印的位点阵列，将18条探针按探针名称对应分别点加在尼龙膜相应位点上，探针上的氨基与尼龙膜表面的羧基发生交联反应；e.待尼龙膜条干燥后，用0.1mol/L的NaOH泡膜5分钟，以封闭尼龙膜表面未反应的羧基；f.纯水洗涤尼龙膜，干燥后备用。本专利技术的制备方法通过固定探针的膜条表面带有羧基集团，能与探本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种乙肝表面抗原免疫逃逸突变基因检测膜条，包括基底以及在所述基底上固定有正常对照探针和特异性的突变检测探针，其特征在于：共包括用于检测9个基因突变位点的10条突变检测探针和8条正常对照探针，所述9个基因突变位点分别为C358A、A376T、T377G、A378C、G388G389A390/A388A389C390、C428T、A431C、G433A和G434C。

【技术特征摘要】
1.一种乙肝表面抗原免疫逃逸突变基因检测膜条，包括基底以及在所述基底上固定有
正常对照探针和特异性的突变检测探针，其特征在于：共包括用于检测9个基因突变位点的
10条突变检测探针和8条正常对照探针，所述9个基因突变位点分别为C358A、A376T、T377G、
A378C、G388G389A390/A388A389C390、C428T、A431C、G433A和G434C。
2.根据权利要求1所述的一种乙肝表面抗原免疫逃逸突变基因检测膜条，其特征在于：
所述10条突变检测探针分别为：358BM、358CM、376M、377M、387M、388M、428M、431M、433M和
434M，所述10条突变检测探针的3’端或5’端均带有氨基标记。
3.根据权利要求2所述的一种乙肝表面抗原免疫逃逸突变基因检测膜条，其特征在于：
所述突变检测探针的具体序列分别为：
358BMGCACCGGAACATGCA
358CMCACGGGAACATGCAAG
376MCTGCACATCTCCTGCT
TGCACGTCTCCTGCT
377MTGCACGAGTCCTGCT
387MCTGCTCACGGAACCTC
388MCTGCTCAAAACACCTCT
428MCAAAACCTWTGGACGG
431MCTACGGCCGGAAACT
433MCGGACAGAAACTGCAC
434MCGGACGCAAACTGC。
4.根据权利要求1所述的一种乙肝表面抗原免疫逃逸突变基因检测膜条，其特征在于：
所述8条正常对照探针分别为：358BN、358CN、376N、377N、387N、388N、428N和431/433/434N，
所述8条正常对照探针的3’端或5’端均带有氨基标记。
5.根据权利要求4所述的一种乙肝表面抗原免疫逃逸突变基因检测膜条，其特征在于：
所述正常对照探针的具体序列分别为：
358BNCACCGGACCATGCA
358CNACGGGACCATGCAAG
376NCTGCACAACTCCTGCT
TGCACGACTCCTGCT
377NTGCACGATTCCTGCT
TGCACGACTCCTGC
387NCTGCTCAAGGAACCTCT
388NCTGCTCAAGGAACCTCT
428NCAAAACCTWCGGACG
431/433/434NTCGGACGGAAACT。
6.根据权利要求4所述的一种乙肝表面抗原免疫逃逸突变基因检测膜条，其特征在于：
所述检测膜条上的探针阵列具体...

【专利技术属性】
技术研发人员：马强，陆小梅，黎四平，刘倩，马可泽，何晓光，
申请(专利权)人：东莞市第八人民医院，
类型：发明
国别省市：广东;44