P450sca‑2酶突变体、其制备方法和应用技术

本发明专利技术涉及一种分离的多肽，其是SEQ ID NO:1所示的P450sca‑2酶的变体或所述变体的生物学活性片段，其中所述多肽在对应于SEQ IDNO:1所示序列中的G52、F89、P159、D269、T323和E370位置上包括氨基酸取代，而且相对于SEQ ID NO:1所示的P450sca‑2酶，所述多肽在宿主细胞中表达时赋予所述宿主细胞提高的在含十氢萘环化合物的十氢萘环的6β位引入羟基的能力。本发明专利技术还涉及编码上述分离的多肽的多核苷酸，包含所述多核苷酸的重组载体，包含所述多核苷酸或所述重组载体的宿主细胞，以及通过所述宿主细胞转化美伐他汀以制备普伐他汀的方法。本发明专利技术的方法可以提高从美伐他汀转化制备普伐他汀的产率。

P450sca 2 enzyme mutant, preparation method and application thereof

The present invention relates to a polypeptide separation, which is SEQ ID NO:1 P450sca shown biological active fragment variant 2 enzymes or the variants, wherein the peptide corresponding to the SEQ IDNO:1 shown in the sequence of G52, F89, P159, D269, T323 and E370 positions including amino acids instead, but compared to the SEQ ID NO:1 P450sca shown 2 enzymes, the polypeptide expression gives the host cells to improve the ability in the 6 beta ten hydrogen naphthalene containing ten hydrogen naphthalene compound ring introducing hydroxyl groups in host cells. The invention also relates to the polypeptide encoding isolated polynucleotides, recombinant vectors comprising the polynucleotides, comprising the polynucleotides or the recombinant vectors and host cells through the host cell transformation of Mevastatin pravastatin for preparation. The method of the invention can improve the yield of pravastatin produced by the transformation of atorvastatin.

【技术实现步骤摘要】
P450sca-2酶突变体、其制备方法和应用
本专利技术涉及生物工程领域。更具体地，本专利技术涉及P450sca-2酶突变体、其制备方法、以及其在从美伐他汀制备普伐他汀中的应用。
技术介绍
高脂血症正在不断的威胁着人们的健康，因此降血脂药的开发成为制药行业的一个重要目标。普伐他汀(pravastatin)是一种非常重要的降血脂药(TsujitaY等,1986,Biochim.Biophys.Acta877,50-60;KogaT等,1990,Biochim.Biophys.Acta1045,115-120)。普伐他汀钠的工业生产是两步发酵过程，包括从橘青霉(Penicilliumcitrinum)发酵生产美伐他汀(mevastatin)，经过浓碱处理制成美伐他汀钠，最后利用微生物转化的方法将美伐他汀钠羟基化制成普伐他汀钠(SerizawaN.,1996Biotechnol.Annu.Rev.2,373-389)。嗜碳链霉菌(Streptomycescarbophilus)具有较强将美伐他汀钠羟基化制备普伐他汀钠的能力，广泛用于普伐他汀的工业生产(SerizawaN.,1996Biotechnol.Annu.Rev.2,373-389)。通过对此羟基化过程的机理进行研究，发现其中起主要催化作用的酶属于细胞色素P450酶系，根据其来源命名为P450sca(MatsuokaT等,1989,Eur.J.Biochem.184,707-713)。从嗜碳链霉菌中共纯化出两种P450sca酶，分别命名为P450sca-1酶和P450sca-2酶。这两种P450sca酶具有类似的分子量(46±1kDa)和氨基酸组成(疏水氨基酸含量46-47%)。P450sca-2在催化美伐他汀转化为普伐他汀中的比活性高于P450sca-1的比活性，并且其易于被纯化，因此P450sca-2被普遍应用于生物发酵法制备普伐他汀中。然而，目前通过生物发酵法制得的普伐他汀的产率较低，因此需要更高效的P450sca-2酶来提高普伐他汀的产率。
技术实现思路
一方面，本专利技术涉及一种分离的多肽，其是SEQIDNO:1所示的P450sca-2酶的变体或所述变体的生物学活性片段，其中所述多肽在对应于SEQIDNO:1所示序列中的G52、F89、P159、D269、T323和E370位置上包括氨基酸取代，而且相对于SEQIDNO:1所示的P450sca-2酶，所述多肽在宿主细胞中表达时赋予所述宿主细胞提高的在含十氢萘环化合物的十氢萘环的6β位引入羟基的能力。在一个实施方式中，所述氨基酸取代为G52S、F89I、P159A、D269E、T323A和E370V，且所述多肽包括SEQIDNO:2所示的序列。在另一个实施方式中，所述多肽的氨基酸序列进一步包括在对应于SEQIDNO:1所示序列中的选自T119、N363、T85、V194和它们任意组合的位置上的氨基酸取代。在一个实施方式中，所述氨基酸取代在T119位置上。在一个实施方式中，所述氨基酸取代在N363位置上。在一个实施方式中，所述氨基酸取代在T85位置上。在一个实施方式中，所述氨基酸取代在V194位置上。在一个实施方式中，所述氨基酸取代在T119和N363位置上。在一个实施方式中，所述氨基酸取代在T119和T85位置上。在一个实施方式中，所述氨基酸取代在T119和V194位置上。在一个实施方式中，所述氨基酸取代在N363和T85位置上。在一个实施方式中，所述氨基酸取代在N363和V194位置上。在一个实施方式中，所述氨基酸取代在T85和V194位置上。在一个实施方式中，所述氨基酸取代在T119、N363和T85位置上。在一个实施方式中，所述氨基酸取代在T119、N363和V194位置上。在一个实施方式中，所述氨基酸取代在T119、T85和V194位置上。在一个实施方式中，所述氨基酸取代在N363、T85和V194位置上。在一个实施方式中，所述氨基酸取代在T119、N363、T85和V194位置上。在一个实施方式中，所述N363位置的氨基酸取代为N363Y或N363H。在一个实施方式中，所述T119位置的氨基酸取代为T119S、T119C或T119N。在一个实施方式中，其中所述V194位置的氨基酸取代为V194C、V194N或V194T。在一个实施方式中，其中所述T85位置的氨基酸取代为非极性疏水氨基酸，所述非极性疏水氨基酸选自以下组成：甲硫氨酸、丙氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、脯氨酸、缬氨酸、苯丙氨酸和色氨酸。在一个实施方式中，其中所述T85位置的氨基酸取代为T85M、T85L、T85F或T85I。在一个实施方式中，所述氨基酸取代为T119S、N363Y、T85F和T194N。另一方面，本专利技术涉及一种分离的多肽，其包含选自以下的氨基酸序列或由选自以下的氨基酸序列组成：i)SEQIDNO:2、SEQIDNO:3、SEQIDNO:4、SEQIDNO:5、SEQIDNO:6、SEQIDNO:7、SEQIDNO:8、SEQIDNO:9、SEQIDNO:10、SEQIDNO:11、SEQIDNO:12、SEQIDNO:13、SEQIDNO:14、SEQIDNO:15或SEQIDNO:16；ii)与SEQIDNO:2、SEQIDNO:3、SEQIDNO:4、SEQIDNO:5、SEQIDNO:6、SEQIDNO:7、SEQIDNO:8、SEQIDNO:9、SEQIDNO:10、SEQIDNO:11、SEQIDNO:12、SEQIDNO:13、SEQIDNO:14、SEQIDNO:15或SEQIDNO:16所示的氨基酸序列具有至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%的序列相同性的氨基酸序列；或iii)与SEQIDNO:2、SEQIDNO:3、SEQIDNO:4、SEQIDNO:5、SEQIDNO:6、SEQIDNO:7、SEQIDNO:8、SEQIDNO:9、SEQIDNO:10、SEQIDNO:11、SEQIDNO:12、SEQIDNO:13、SEQIDNO:14、SEQIDNO:15或SEQIDNO:16所示的氨基酸序列相比经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸的氨基酸序列；而且所述多肽在宿主细胞中表达时赋予所述宿主细胞提高的在含十氢萘环化合物的十氢萘环的6β位引入羟基的能力。另一方面，本专利技术涉及一种分离的多肽，其是SEQIDNO:1所示的P450sca-2酶的变体或所述变体的生物学活性片段，其中所述多肽在对应于SEQIDNO:1所示序列中的T119、N363、T85和V194中的一个或多个位置上包括氨基酸取代，而且相对于SEQIDNO:1所示的P450sca-2酶，所述多肽在宿主细胞中表达时赋予所述宿主细胞提高的在含十氢萘环化合物的十氢萘环的6β位引入羟基的能力。在一个实施方式中，所述氨基酸取代在T119位置上。在一个实施方式中，所述氨基酸取代在N363位置上。在一个实施方式中，所述氨基酸取代在T85位置上。在一个实施方式中，所述氨基酸取代在V194位置上。在一个实施方式中，所述氨基酸取代在T119和N363位置上。在一个实施方式中，所本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种分离的多肽，其是SEQ ID NO:1所示的P450sca‑2酶的变体，其中所述多肽在对应于SEQ ID NO:1所示序列中的G52、F89、P159、D269、T323和E370位置上包括氨基酸取代，其中所述氨基酸取代为G52S、F89I、P159A、D269E、T323A和E370V，而且相对于SEQ ID NO:1所示的P450sca‑2酶，所述多肽在宿主细胞中表达时赋予所述宿主细胞提高的在含十氢萘环化合物的十氢萘环的6β位引入羟基的能力。

【技术特征摘要】
1.一种分离的多肽，其是SEQIDNO:1所示的P450sca-2酶的变体，其中所述多肽在对应于SEQIDNO:1所示序列中的G52、F89、P159、D269、T323和E370位置上包括氨基酸取代，其中所述氨基酸取代为G52S、F89I、P159A、D269E、T323A和E370V，而且相对于SEQIDNO:1所示的P450sca-2酶，所述多肽在宿主细胞中表达时赋予所述宿主细胞提高的在含十氢萘环化合物的十氢萘环的6β位引入羟基的能力。2.权利要求1的分离的多肽，其中所述多肽的氨基酸序列进一步包括在对应于SEQIDNO:1所示序列中的选自T119、N363、T85、V194和它们任意组合的位置上的氨基酸取代，其中所述N363位置的氨基酸取代为N363Y或N363H；所述T119位置的氨基酸取代为T119S、T119C或T119N；所述V194位置的氨基酸取代为V194C、V194N或V194T；且所述T85位置的氨基酸取代为T85M、T85L、T85F或T85I。3.权利要求2的分离的多肽，其中所述多肽的氨基酸序列进一步包括氨基酸取代T119N、N363Y、T85I和V194T。4.权利要求2的分离的多肽，其中所述多肽的氨基酸序列进一步包括氨基酸取代T119S、N363Y、T85F和V194N。5.一种分离的多肽，其由选自以下的氨基酸序列组成：SEQIDNO:2、SEQIDNO:3、SEQIDNO:4、SEQIDNO:5、SEQIDNO:6、SEQIDNO:7、SEQIDNO:8、SEQIDNO:9、SEQIDNO:10、SEQIDNO:11、SEQIDNO:12、SEQIDNO:13、SEQIDNO:14、SEQIDNO:15或SEQIDNO:16；而且所述多肽在宿主细胞中表达时赋予所述宿主细胞提高的在含十氢萘环化合物的十氢萘环的6β位引入羟基的能力。6.权利要求1-5任一项所述的分离的多肽，所述含十氢萘环的化合物为他汀类药物。7.权利要求6所述的分离的多肽，所述他汀类药物为美伐他汀。8.权利要求1-5任一项所述的分离的多肽，所述宿主细胞是原核微生物。9.权利要求8所述的分离的多肽，所述原核微生物选自以下组中：大肠杆菌(Escherichiacoli)、枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)、自养假诺卡氏菌(Pseudono...

【专利技术属性】
技术研发人员：林章凛，巴丽娜，李盼，张晖，段妍，
申请(专利权)人：清华大学，
类型：发明
国别省市：北京,11