一种高比活L-谷氨酸氧化酶基因多位点突变体及其制备方法和应用技术

一种高比活L-谷氨酸氧化酶基因多位点突变体及其制备方法和应用，其核苷酸序列如SEQ ID No 64所示，其编码蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID No 65所示。采用分子体外重组技术筛选高活性L-谷氨酸氧化酶基因，通过载体构建、酶活性筛选以及多位点突变技术等制备得到所述高比活L-谷氨酸氧化酶基因多位点突变体，该多位点突变体在同一基因上含有9个不同突变位点，使该多位点突变体对L-谷氨酸的氧化专一性和比活性均大幅度提高，可应用于检测食物中L-谷氨酸的含量。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于微生物领域，涉及一种来源于淀粉酶产色链霉菌的高比活L-谷氨酸氧化酶基因多位点突变体及其制备方法和应用。
技术介绍
L-谷氨酸氧化酶(L-Glutamateoxidase，LGOX)能专一地催化谷氨酸氧化成α-酮戊二酸和过氧化氢，因此，通过过氧化氢含量的变化可以方便地测定谷氨酸的含量。然而，主要因为L-谷氨酸氧化酶产品的来源问题还未从根本上得到解决，使得L-谷氨酸氧化酶的价格还很昂贵，导致其应用受到限制。1983年，日本人Kamei等首次从浅紫链霉菌(Streptomycesviolascens)麦麸培养基抽提物中发现一种能催化谷氨酸氧化产生α-酮戊二酸和过氧化氢的酶，该酶是典型的氧化酶而不是脱氢酶，NAD+，NADP+不能作为该酶的电子受体，因此将其命名为L-谷氨酸氧化酶(ChemPharmBull，1983，31，1307-1314)。该酶的分子量约为60KD，具有黄素蛋白(FAD)的特征性吸收光谱(吸收峰为490nm)，每摩尔酶中含有1个摩尔的FAD。底物特异性研究表明，在pH5.0-6.5范围内，它能有效地催化L-谷氨酸的氧化，并且对L-谷氨酰胺、L-酪氨酸和L-组氨酸有微弱的氧化作用；在pH6.8时，对L-谷氨酰胺和L-组氨酸的相对活性分别为L-谷氨酸的32.1％和13.1％，Km值分别3.3和5.0mM。在pH5.0时，对L-谷氨酸和L-谷氨酰胺的Km值分别为1.1mM和10mM。该酶的稳定性较好，在pH3.0-7.0范围内，37℃可稳定1小时。同年，Kusakabe等从另外一株链霉菌X-119-6(Streptomycessp.X-119-6)菌株中分离出特异性更好的L-谷氨酸氧化酶，以L-谷氨酸为底物的Km值仅为0.2mM。该酶分子量大约为140000，由三个亚基组成，每个酶分子上结合有2个FAD，最适pH为7.0-8.0。该酶耐热性较强，在pH5.5的条件下，65℃加热15分钟不失活；75℃加热15分钟，活性为87％；85℃加热15分钟，活性仍能保留47％。该酶除催化L-谷氨酸氧化外，仅对L-天冬氨酸有微弱的催化作用(在pH7.4时，相对活性为L-谷氨酸的0.6％)。1989年，德国Bohmer等从内涂链霉菌(Streptomycesendus)中分离纯化到对L-谷氨酸完全特异的L-谷氨酸氧化酶。其分子量为90000，由两个亚基构成，亚基分子量为50000，每个亚基含有一个非共价结合的FAD。在pH7.0时对L-谷氨酸km值为1.1mM。2001年，台湾Chen等从普拉特链霉菌NTU3304(StreptomycesplatensisNTU3304)纯化获得L-谷氨酸氧化酶，该酶对L-谷氨酸专化性好，用作生物传感器时只对L-谷氨酸反应；2000年俄罗斯Sukhacheva等筛选到一株产L-谷氨酸氧化酶的链霉菌Streptomycessp.Z-l1-6，经过亚硝酸诱变，酶的比活为50.8U/mg，该酶特异性好，只氧化L-谷氨酸，不受其它氨基酸的影响。2004年，泰国Wachiratianchai等从另一株链霉菌Streptomycessp.18G中纯化获得了一个新的L-谷氨酸氧化酶，该酶由两个亚基组成分子量为120000，最适pH为pH7.0，对L-谷氨酸底物比较专一，对D-谷氨酸和D-天冬氨酸的相对活性只有0.79％和0.53％。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种来源于淀粉酶产色链霉菌的高比活L-谷氨酸氧化酶基因多位点突变体及其制备方法和应用，利用DNA分子重排方法和高通量筛选法对L-谷氨酸氧化酶基因进行定向筛选，获得多个与酶活性相关位点，通过多位点突变技术，将所有突变位点整合到一条基因中，获得多位点突变体，该多位点突变体对L-谷氨酸的氧化专一性和比活性均大幅度提高。为达到上述目的，本专利技术的技术方案如下：一种高比活L-谷氨酸氧化酶基因多位点突变体，其核苷酸序列如SEQIDNo64所示。在所述多位点突变体编码的氨基酸序列上共有9处突变位点，其中，突变1位点为D32A即第32位上的天冬氨酸被替换为丙氨酸；突变2位点为H54P即第54位上的组氨酸被替换为脯氨酸；突变3位点为Y144F即第144位的酪氨酸被替换为苯丙氨酸；突变4位点为G155D即第155位上的甘氨酸被替换为天冬氨酸；突变5位点为T166K即第166位上的苏氨酸被替换为赖氨酸；突变6位点为T319K即第319位上的苏氨酸被替换为赖氨酸；突变7位点为A362V即第362位上的丙氨酸被替换为缬氨酸；突变8位点为S567F即第569位的丝氨酸被替换为苯丙氨酸；突变9位点为K600R即第600位上的赖氨酸被替换为精氨酸。具体地，所述高比活L-谷氨酸氧化酶基因多位点突变体编码蛋白质的氨基酸序列如SEQIDNo65所示。本专利技术所述高比活L-谷氨酸氧化酶基因多位点突变体的制备方法，其包括如下步骤：(1)DNA分子重排通过基因合成方法合成来源于淀粉酶产色链霉菌的L-谷氨酸氧化酶基因，以合成的L-谷氨酸氧化酶基因为模板，扩增L-谷氨酸氧化酶基因，回收1974bp的基因片段，以DNaseI进行不完全酶解，并回收小片段；再对回收的酶解片段进行无引物PCR扩增，然后以无引物PCR产物为模板，SDLG1、SDLG49为引物扩增重排L-谷氨酸氧化酶基因片段，并回收1974bp基因片段。(2)高比活L-谷氨酸氧化酶基因高通量筛选将回收的重排L-谷氨酸氧化酶基因片段经BamHI和SacI双酶切后，构建入原核表达载体pG251(CN1338515)启动子和t1t2终止子之间，电击法转化大肠杆菌菌株DH5α获得突变体表达文库，而后进行质粒提取。将提取的质粒转入大肠杆菌，涂板于含有氨苄青霉素抗生素的培养基上培养，获得抗性转化子。以40个抗性转化菌落为一个单元，挑入40孔细菌培养板。利用溶菌酶破碎细胞，加入酶测定液，挑取显黄色的加样孔，对该加样孔中的40个单菌进行再一轮的筛选，并对筛选出的突变单菌进行比活以及对谷氨酸底物的专一性测定，从中挑选5个比活性高且谷氨酸底物专一的突变体。对上述5个突变基因进行DNA序列分析，显示其氨基酸突变有9个位点即D32A，H54P，Y144F，G155D，T166K，T319K，A362V，S567F，K600R。(3)多位点突变以L-谷氨酸氧化酶基因为模版，按照多位点突变技术将上述9个位点同时突变即D32A，H54P，Y144F，G155D，T166K，T319K，A362V，S567F，K600R，获得本专利技术的高比活L-谷氨酸氧化酶基因多位点突变体。进一步，步骤(3)中，以氨基酸突变了3个位点：D32A、Y144F、K600R的L-谷氨酸氧化酶基因为模版，将其氨基酸第54、155、166、319、362、567位进行突变，完成9个位点同时突变即D32A，H54P，Y144F，G155D，T166K，T319K，A362V，S567F，K600R，所述突变所用引物如下：H54P突变引物：54Z：GCCGCCTCGGCCCCACCCCCCA54F：TGGGGGGTGGGGCCGAGGCGGCG155D突变引物：155Z：TGGGCCCCTCCACCGGCAGCGAC155F:GTCGCTGCCGGTGGAG本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种高比活L‑谷氨酸氧化酶基因多位点突变体，其核苷酸序列如SEQ ID No 64所示。

【技术特征摘要】
1.一种高比活L-谷氨酸氧化酶基因多位点突变体，其核苷酸序列如SEQIDNo64所示。2.根据权利要求1所述的高比活L-谷氨酸氧化酶基因多位点突变体，其特征在于，所述多位点突变体编码蛋白质的氨基酸序列如SEQIDNo65所示。3.如权利要求1所述的L-谷氨酸氧化酶基因多位点突变体的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：1)DNA分子重排通过基因合成方法合成来源于淀粉酶产色链霉菌的L-谷氨酸氧化酶基因，以合成的L-谷氨酸氧化酶基因为模板，扩增L-谷氨酸氧化酶基因，回收1974bp的基因片段，以DNaseI进行不完全酶解，并回收小片段；再，对回收的酶解片段进行无引物PCR扩增，然后以无引物PCR产物为模板，SDLG1、SDLG49为引物扩增重排L-谷氨酸氧化酶基因片段，并回收1974bp基因片段；2)高比活L-谷氨酸氧化酶基因高通量筛选将回收的重排L-谷氨酸氧化酶基因片段经BamHI和SacI双酶切后，构建入原核表达载体pG251启动子和t1t2终止子之间，电击法转化大肠杆菌菌株DH5α获得突变体表达文库，而后进行质粒提取；将提取的质粒转入大肠杆菌，涂板于含有氨苄青霉素抗生素的培养基上培养，获得抗性转化子；以40个抗性转化菌落为一个单元，挑入40孔细菌培养板；利用溶菌酶破碎细胞，加入酶测定液，挑取显黄色的加样孔，对该加样孔中的40个单菌进行再一轮的筛选，并对筛选出的突变单菌进行比活以及对谷氨酸底物的专一性测定，从中挑选5个比活性高且对谷氨酸底物专一的突变体；对上述5个突变基因进行DNA序列分析，显示其氨基酸突变有9个位点即D32A，H54P，Y144F，G155D，T166K，T319K，A362V，S567F，K600R；3)多位点突变以L-谷氨酸氧化酶基因为模版，将...

【专利技术属性】
技术研发人员：彭日荷，姚泉洪，王荣谈，田永生，王丽娟，丁卫星，严培兰，王波，孙斌，
申请(专利权)人：上海市农业科学院，上海瑞丰农业科技有限公司，
类型：发明
国别省市：上海;31