本发明专利技术涉及分子生物学领域，公开了一种猪天然免疫分子LGP2的突变体蛋白LGP2S169A及其制备和应用。LGP2S169A突变体蛋白序列为SEQ ID No.4中氨基酸所示。所述构建含有SEQ ID No.4中氨基酸序列的LGP2S169A的质粒所表达的蛋白具有良好的抗口蹄疫病毒的作用,为制备抗口蹄疫病毒药物或佐剂提供了新的靶点和理论支持。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种蛋白突变体及其制备方法和用途，确切讲本专利技术涉及一种猪LGP2突变体，以及这种突变体的制备方法和用途。
技术介绍
口蹄疫病毒（foot and mouth disease virus，FMDV）属于微RNA病毒科（Picornaviridae）口蹄疫病毒属（Aphthovirus），核酸类型为单链正股RNA，包含七个血清型，各型之间无交叉保护反应。口蹄疫是由FMDV感染偶蹄类动物（猪、牛、羊、骆驼等）引起的急性、热性和接触性的一类传染病。该病的发病率高、传染迅速、危害严重，是世界动物卫生组织（OIE）规定的A类烈性动物传染病,我国列为一类动物传染病。扑杀是口蹄疫疫情控制的主要手段，因此该病的爆发和流行对全球养殖业造成了巨大的危害，我国作为一个养殖业大国，也深受口蹄疫的危害。如何有效地控制、预防和治疗口蹄疫是当前科研工作者的一个重要使命和责任。由于口蹄疫血清较多，型间无交叉保护，这给以疫苗免疫为主的控制措施带来了巨大的挑战。而制备用于治疗口蹄疫的药物、制备用于预防或治疗口蹄疫的疫苗是本领域关注的一个重点方向。模式识别受体（Pattern Recognition Receptors，PRRs）是机体抵抗病原微生物感染的第一道防线，是启动机体先天性免疫反应的重要组成部分。病原微生物感染细胞后，PRRs通过识别病原的病原相关分子模式（pathogen-associated molecular patterns, PAMPs），促进下游干扰素和细胞因子的分泌，激活一些抗菌或抗病毒蛋白的表达，启动先天性免疫应答。PAMPs为病原微生物所特有，是病原微生物（及其产物）共有的一些非特异性和高度保守的分子结构，可被非特异性免疫细胞所识别。因此，对模式识别受体介导抗病毒作用的研究，对了解机体发挥先天性免疫抵抗各类病原微生物具有重要意义。迄今为止，已经发现的模式识别受体有四类：TLRs(Toll-like receptors)，RLRs（Retinoic acid-inducible geneⅠ(RIG-Ⅰ)-like helicases receptors, RIG-I-like receptors），NLRs(NOD-like receptors)和CLRs(C-type lectin receptors)。这些分子分工明确，相互协调，调控机体免疫反应，发挥抗感染作用。RIG-I样受体为模式识别受体中的一类分子，该家族成员至今发现有RIG-Ⅰ、MDA5和LGP2三种分子。RIG-I样受体通过RLR级联信号诱导I型干扰素和炎症因子的产生，在抗病毒天然免疫中起着非常重要的作用。为了更好地控制口蹄疫的流行和传播，除了深入探索FMDV遗传变异与血清型分布的规律外，同时还需要研究宿主细胞蛋白与FMDV的关系。因为FMDV在感染过程中为了便于自身的复制，经常会修饰或者改变一些宿主蛋白的结构与功能，使得这些宿主蛋白能够有利于病毒自身的复制。病毒篡夺细胞功能为其服务是病毒在进化过程中形成的保持自身繁衍的一种重要手段和机制，因此研究清楚哪些宿主细胞在病毒复制过程中被其利用，以及其利用的具体机制有哪些，这将有利于开发一些抑制病毒复制的佐剂或药物。通过阻断病毒与宿主蛋白结合的靶向位点，使其不能够利用这些蛋白，从而抑制病毒的复制。LGP2被报道在体外具有负调节RIG-I和MDA5的作用（Takeshi Saito et al. 2006, PNAS）。但Takashi Satoh报道LGP2基因敲除型小鼠极易被EMCV等病毒感染，而野生型小鼠的感染率明显偏低，但这一点在针对口蹄疫病毒方面的表现却并不清楚。
技术实现思路
本专利技术目的在于提供一种猪LGP2突变体蛋白，以及这种蛋白的制备及在制备抗口蹄疫病毒感染的药物或疫苗中的应用。本专利技术的猪天然免疫蛋白LGP2的突变体其氨基酸序列为SEQ ID NO.4。本专利技术的氨基酸序列为SEQ ID NO.4的猪天然免疫蛋白LGP2的突变体的制备方法是：首先以猪的cDNA为模板，用引物首先构建表达猪LGP2的真核表达质粒，再以猪LGP2的真核表达质粒为模板，用引物SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6进行突变PCR，得到目标产物。本专利技术的猪天然免疫蛋白LGP2的突变体可在用于制备抗口蹄疫病毒感染的药物或疫苗中应用。本专利技术的相关实验表明，经突变本专利技术的突变体与猪天然免疫蛋白LGP2相比能更显著的抑制口蹄疫病毒复制，表现出其在制备抗口蹄疫病毒感染的药物或疫苗中的应用的可能。附图说明图1 为LGP2全基因的PCR图。附图标记说明：泳道M：DNA Marker 5000；泳道1PCR扩增核酸片段。图2 为构建LGP2真核表达质粒酶切鉴定结果。泳道M：DNA Marker 5000；泳道1酶切后核酸片段。图3为构建LGP2S169A突变PCR结果电泳图。附图标记说明：泳道M：DNA Marker 5000；泳道1PCR扩增的突变质粒核酸片段。图4 为构建LGP2S169A真核表达质粒酶切鉴定结果。泳道M：DNA Marker 5000；泳道1酶切后核酸片段。图5 为口蹄疫病毒感染PK-15细胞不同时间点口蹄疫病毒的mRNA表达水平结果。口蹄疫病毒感染PK-15细胞后0、2、4、8、12和24小时口蹄疫病毒mRNA的相对表达水平。图6为口蹄疫病毒感染PK-15细胞不同时间点细胞中LGP2基因mRNA表达水平qPCR检测结果。口蹄疫病毒感染PK-15细胞后0、2、4、8、12和24小时细胞LGP2基因mRNA的相对表达水平。结果表明口蹄疫病毒感染可以上调细胞中LGP2 mRNA的表达水平。图7为 口蹄疫病毒感染对LGP2蛋白表达水平的降解Western blot检测结果。未感染组为转染Myc-LGP2质粒未感染口蹄疫病毒的PK-15细胞中Myc-LGP2蛋白水平，感染组为转染Myc-LGP2质粒后感染口蹄疫病毒的PK-15细胞中Myc-LGP2的蛋白水平；结果表明口蹄疫病毒感染可以减少LGP2的蛋白表达水平。图8为口蹄疫病毒感染与不感染的PK-15细胞中Myc-LGP2的mRNA表达水平qPCR的结果图。未感染组指转染2μg Myc-LGP2质粒不感染口蹄疫病毒细胞中Myc-LGP2的蛋白表达量，感染组为转染2μg Myc-LGP2质粒感染口蹄疫病毒细胞中Myc-LGP2的蛋白表达量。结果表明口蹄疫病毒感染不降解LGP2 的mRNA。图9为过表达LGP2蛋白对口蹄疫病毒复制影响的qPCR检测结果。柱状图为PK-15细胞转染Myc-LGP2质粒0、1、2和3μg质粒后接种口蹄疫病毒12小时口蹄疫病毒mRNA的表达水平。结果表明随着Myc-LGP2表达量的增加，口蹄疫病毒的mRNA水平显著下降，病毒复制被显著抑制。图10为过表达LGP2蛋白对口蹄疫病毒复制影响的病毒滴度检测结果。结果表明随着Myc-LGP2表达量的增加，口蹄疫病毒的滴度显著下降，病毒复制被显著抑制。图11为过表达LGP2蛋白对口蹄疫病毒复制影响的western blot检测结果。4个泳道分别为转染Myc-LGP2质粒0、1、2和3μg质粒后接种口蹄疫病毒12小时LGP2及口蹄疫病毒蛋白的表达水平，β-Actin为内参。结果表明随本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种猪天然免疫蛋白LGP2的突变体，其特征在于突变体的氨基酸序列为SEQ ID NO.4。
【技术特征摘要】
1.一种猪天然免疫蛋白LGP2的突变体，其特征在于突变体的氨基酸序列为SEQ ID NO.4。2.权利要求1所述的猪天然免疫蛋白LGP2的突变体的制备方法，其特征在于：首先以猪的cDNA为模板，用引物首先构建表达猪LGP2的真...
【专利技术属性】
技术研发人员：朱紫祥，郑海学，曹伟军，杨帆，杜晓莉，毛箬青，李丹，田宏，张克山，刘湘涛，
申请(专利权)人：中国农业科学院兰州兽医研究所，
类型：发明
国别省市：甘肃;62
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