本发明专利技术公开了一种CD19免疫原多肽，属于抗癌疫苗领域。具体涉及用作抗癌疫苗的CD19免疫原的优化多肽，增强T细胞免疫应答。该氨基酸序列为全新的序列，在制备用于治疗肿瘤药物中的应用。尤其在制备用于肿瘤免疫细胞，增强T细胞免疫应答药物中的应用，以及在制备用于CAR‑T细胞免疫治疗的应用。本发明专利技术的有益效果在于为全新的序列，可用于肿瘤免疫细胞技术中的免疫原，能（1）促进T细胞，（2）促进CD8+免疫应答，（3）能与T细胞表面的MHC有效的特异性结合，（4）促进T细胞与肿瘤细胞的结合，（5）在荷瘤小鼠体内，能抑制肿瘤的生长。作为细胞疗法的靶标分子，应用于CAR‑T等细胞疗法。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术是有关抗癌疫苗领域。具体来说，本专利技术涉及用作抗癌疫苗的CD19免疫原的优化多肽，增强T细胞免疫应答。
技术介绍
B细胞淋巴瘤是B细胞发生的实体肿瘤通常发生于儿童和成年人，是一种攻击免疫系统中B细胞的癌症类型。包括霍奇金淋巴瘤和非霍奇金淋巴瘤。其分型众多，经典霍奇金淋巴瘤和结节性淋巴细胞为主型霍奇金淋巴瘤，现在被认为是起源于B细胞的肿瘤。弥漫性大B细胞淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤、黏膜相关淋巴组织淋巴瘤(MALT)、小淋巴细胞淋巴瘤/慢性淋巴细胞白血病、套细胞淋巴瘤(MCL)5种B细胞非霍奇金淋巴瘤最为常见，占非霍奇金淋巴瘤的3/4。B细胞淋巴瘤的预后和治疗取决于淋巴瘤的具体类型以及分期分级。目前的治疗手段以化疗为主，但化疗对身体伤害很大，以后康复了身体抵抗力也会变得很差。研究人员发现B细胞淋巴瘤细胞表面受体CD19起着关键作用。CD19是一种B细胞特异性转膜糖蛋白，表达于B系细胞(不包括成熟浆细胞)及滤泡树突状细胞上，CD19是一种重要的信号传导分子，调节B淋巴细胞的生长激活和活化，在调节B淋巴细胞抗原受体或其他表面受体的信号阈值中起重要作用，是与B淋巴细胞分化、活化、增殖及抗体产生有关的重要膜抗原，是诊断B淋巴细胞系肿瘤的最好标志，如慢性淋巴细胞白血病(CLL)和急性淋巴细胞白血病(ALL)。目前已经有肿瘤的临床试验测试对抗CD19受体的抗体。这种抗体不仅能杀死B淋巴细胞系肿瘤，同时也能健康的B细胞，从而削弱免疫系统。研究人员希望能够设计更有效的治疗方法，能选择性地杀死肿瘤细胞，同时保留健康的B细胞，产生更安全、有效的临床治疗效果。肿瘤细胞免疫治疗是一种新兴的、具有显著疗效的肿瘤治疗模式，是一种自身免疫抗癌的新型治疗方法。它是运用生物技术和生物制剂对从病人体内采集的免疫细胞进行体外培养和扩增后回输到病人体内的方法，来激发，增强机体自身免疫功能，从而达到治疗肿瘤的目的。肿瘤细胞免疫疗法是继手术、放疗和化疗之后的第四大肿瘤治疗技术。CD19可以作为肿瘤疫苗的特异性免疫原。然而，CD19由95KDa的蛋白，分子量较大，较难得到纯度高的CD19。这样，不仅会给后期的特异性T细胞免疫带来困难，而且会导致患者的自身免疫。因此，本专利技术提供了一种特异性强，纯度较高的小分子多肽作为免疫原。
技术实现思路
专利技术目的本专利技术提供一种CD19免疫原多肽，可用于肿瘤细胞免疫的免疫原，增强T细胞免疫应答，具有分子量小、特异性免疫原性强的特点。技术方案本专利技术的技术方案在于提供一种CD19免疫原多肽，序列为DNAVLQAAVDGPTQQPPSLSRESPLK LLLSLGLPGL(SEQ ID NO：1)。该氨基酸序列为全新的序列，在制备用于治疗肿瘤药物中的应用。尤其在制备用于肿瘤免疫细胞，增强T细胞免疫应答药物中的应用，以及在制备用于CAR-T细胞免疫治疗的应用。有益效果本专利技术的CD19免疫原多肽，为全新的序列，可用于肿瘤免疫细胞技术中的免疫原。有益效果在于(1)促进T细胞，(2)促进CD8+免疫应答，(3)能与T细胞表面的MHC有效的特异性结合，(4)促进T细胞与肿瘤细胞的结合，(5)在荷瘤小鼠体内，能抑制肿瘤的生长。作为细胞疗法的靶标分子，应用于CAR-T等细胞疗法。具体实施方式多肽由上海生工吉尔合成。实施例1T淋巴细胞的增殖作用：无菌取小鼠脾脏，1640培养基清洗3次，5ml注射器芯研磨，200目筛网过滤，制成单细胞悬液，离心(1000r/min，5min)，弃上清，Tris-NH4CL破解红细胞，冰水浴静置3-5min，离心(1000r/min,5min)，弃上清，用无菌冷PBS洗涤细胞两次。最后加入10％小牛血清的RPMI 1640培养液(5ml)悬浮细胞，细胞计数，调整细胞浓度为5×106个/ml，于96孔培养板中培养。实验设空白对照组、模型组(刀豆蛋白A，sigma公司购买)、多肽各剂量(3、6、12mg/ml)组。各组分别加入脾脏淋巴细胞悬液100μl/孔后，空白对照组加入1640培养液100μl，模型组加入ConA(终浓度为5μg/ml)，多肽各剂量组在加入不同浓度的多肽基础上加ConA(终浓度为5μg/ml)。37℃细胞培养箱静止培养48h，培养结束后每孔加入20μl MTT，继续培养4h，最后弃掉每孔所有溶液，每孔加入100μlDMSO，震荡，用酶标仪检测570nm处OD值，每孔设5个平行。表1多肽对T淋巴细胞的增殖作用*P<0.05，**P<0.01与模型组相比。实验结果见表1，与模型组比较，多肽能促进小鼠脾脏淋巴细胞的增殖，在剂量为3～12mg/ml的范围呈现很好的剂量依赖关系。实施例2CD19免疫原多肽的免疫原性测定：采用流式细胞技术测定免疫原多肽对CD8+T细胞的影响。6-8w龄C57BL/6小鼠，小鼠随机分成4组，每组10只。(1)空白组；(2)免疫原多肽低剂量组；(3)免疫原多肽中剂量组；(4)多肽高剂量组。在试验的第0、7、14天，分别进行免疫。方案为：空白组加入相同体积的溶剂，实验组多肽设3个剂量：1、2、4mg/Kg，在小鼠背部淋巴结附近多点注射。30天后，眼球取血0.8ml，肝素抗凝，将血离心后取血细胞层，用红细胞裂解液破解红细胞，洗去裂解的红细胞，再用荧光标记的单克隆抗CD8+-FITC(购自北京华泰昕生物医疗技术有限公司)孵育、固定后，进行流式细胞技术测定，评价免疫原多肽对CD8+T细胞的影响。表2多肽对CD8+T淋巴细胞的作用*P<0.05，**P<0.01与模型组相比。实验结果见表2，与空白组比较，多肽能促进小鼠CD8+T淋巴细胞，在剂量为1～4mg/Kg的范围呈现很好的剂量依赖关系。实施例3应用竞争性受体-配体亲和法测试多肽与MHC的结合能力：将多肽与HLA各型的结合能力由竞争性受体-配体亲和法判断。将固定浓度为50μmol/L的标记125I的多肽以及不同浓度(1-50μmol/L)的多肽加入反应体系(磷酸盐缓冲液和MHC，所述的MHC试剂盒购自上海泛柯生物科技有限公司，试剂盒内有HLA-A1、A2、A3、A11和A24)，在反应体系中形成两种复合物，即待测多肽MHC复合物和125I标记多肽复合物。待测多肽与125I标记多肽竞争与MHC的结合。用超过滤(产品型号Microcon 30，Amicon公司)分离游离多肽和多肽MHC复合物，然后测定多肽MHC复合物的125I放射量，将此放射量与没有竞争性抑制的多肽MHC复合物(没有加待测多肽的样本)的放射量比较，求待测多肽在抑制50％标记多肽与MHC结合时的浓度，即IC50。由此得到，多肽对HLA-A1、A2、A3、A11和A24的IC50值分别为8.24、6.13、3.04、6.19和0.28μmol/L，均符合阳性多肽的标准(≤10μmol/L)。因此，多肽为具有有效结合能力的免疫原多肽。实施例4CD19免疫原多肽的T细胞结合试验：采用玫瑰花环试验评价T细胞与人弥漫大B细胞淋巴瘤(diffuse large B-cell lymphoma,DLBCL)活化B细胞(activated B-cell,ABC)型细胞株OCI-Ly3的结合能力。无菌取豚鼠胸腺，1640培养本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种CD19免疫原多肽，其特征在于：所述的多肽序列为SEQ ID NO：1。
【技术特征摘要】
1.一种CD19免疫原多肽，其特征在于：所述的多肽序列为SEQ ID NO：1。2.根据权利要求1所述的多肽，其特征在于：在制备用于治疗肿瘤药物中的应用。3.根据权利...
【专利技术属性】
技术研发人员：罗瑞雪，
申请(专利权)人：苏州普罗达生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏;32
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