一种动物胶中的共有多肽及其在检测中的应用制造技术

本发明专利技术公开了一种动物胶中的共有多肽及其在检测中的应用。本发明专利技术所提供的共有多肽序列为Gly-Ser-Ala-Gly-Pro-Hyp-Gly-Ala-Thr-Gly-Phe-Hyp-Gly–Ala-Ala-Gly-Arg，该多肽为驴、马、牛、猪、羊、鳖、乌龟、鹿等动物的胶原蛋白序列中所共有，受生产工艺的破坏程度与胶原蛋白多肽成分受工艺的破坏程度基本一致，因此，作为参考物或内标物进行质谱检测可以抵消不同生产工艺的破坏程度不同的影响，使含量测定更加准确，还能及时发现是否掺杂除驴、马、牛、猪、羊、鳖、乌龟、鹿等外的其他动物成分。

【技术实现步骤摘要】
一种动物胶中的共有多肽及其在检测中的应用
本专利技术涉及一种动物胶中的共有多肽及其在检测中的应用，属于中药检测领域。
技术介绍
动物胶为由动物的皮、骨等熬制而成胶类物质，常见的包括阿胶、龟甲胶、鹿角胶、鳖甲胶等。各种胶在药理、临床应用上各有特点，各种胶需用规定动物熬制，比如阿胶由驴皮熬制、黄明胶由牛皮熬制、龟甲胶由龟甲熬制等，否则视为伪劣产品。因各种胶价格差别很大、外观非常相似，市场上出现了造假、制假的不法分子。以阿胶为例，在生产阿胶时，部分甚至全部用各种其他动物皮包括马皮、牛皮、猪皮等，甚至脏皮、烂皮、病死动物之皮等来取代驴皮进行假阿胶的熬制，坑害消费者，谋取非法利益。比较权威的动物胶的真伪鉴别方法主要为DNA分子鉴定法和特征性肽段的质谱检测方法，其中质谱方法已开始纳入国家标准中。已报道的文献中，对用马皮、牛皮、猪皮、羊皮、龟甲、鹿角等熬制的动物胶可以鉴别区分，然而很难发现掺杂其他动物为原料进行造假的情况。动物胶一般经长时间高温蒸煮浓缩，胶中的蛋白多肽遭到不同程度的水解破坏，对于不同工艺生产的动物胶，质谱检测方法在不同动物成分含量检测时产生的偏差较大。如能在动物胶中寻找各动物共有成分作为内标物或参考物，该成分若能在原料中含量相对固定，且受工艺的破坏程度与待检指标成分受工艺的破坏程度一致，则可以抵消工艺影响，达到对不同工艺的动物胶进行精确定量的目的，满足含量检测要求。此外，还可利用共有成分判断样品中是否掺杂其他成分、质谱检测过程中是否正常等问题。
技术实现思路
本专利技术针对上述问题，提供了一种通过检测共有多肽来鉴别动物胶真伪，同时检测动物胶中动物成分含量的方法，该方法操作简单，无需另添加标准物，可以抵消不同生产工艺的破坏程度不同、样品处理过程中酶解不完全等影响，达到精确定量；还能及时发现是否掺杂除驴、马、牛、猪、羊、鳖、乌龟、鹿等外的其他动物成分，质谱检测过程是否正常等。为了达到上述目的，本专利技术采用了以下技术手段：本专利技术提出了一种动物胶中的共有多肽，该共有多肽为驴、马、牛、猪、羊、鳖、乌龟以及鹿的胶原蛋白中所共有，所述共有多肽的氨基酸序列如SEQIDNO.1所示。进一步的，基于上述共有多肽本专利技术还提出了一种鉴别动物胶真伪的方法，其包含以下步骤：1)将已知真胶样品或对照样品及待检的动物胶样品分别采用胰蛋白酶酶切后，放入液质联用仪，设置特征性肽段检测成分后，设置共有多肽作为参考物质或内标物进行检测，所述共有多肽的氨基酸序列如SEQIDNO.1所示；2)分别计算出真胶样品或对照样品中共有多肽的检测峰面积A0、特征性肽段检测峰面积A0′，真胶样品或对照样品的浓度C0，待检的动物胶样品中共有多肽的检测峰面积A1、特征性肽段检测峰面积A1′，待检的动物胶样品的浓度C1；3)判断样品检测情况：a.若A0/C0与A1/C1两者的值相当，即偏差在20％以内，则表明检测正常；b.若A0/C0与A1/C1两者的值相差较大，即偏差大于20％，且两者的特征性肽段检测峰面积与共有多肽峰面积比值A0′/A0与A1′/A1相当，即偏差在20％以内，则表明掺杂了除驴、马、牛、猪、羊、鳖、乌龟、鹿以外的其他动物成分；c.若特征性肽段检测峰面积与共有多肽峰面积比值A0′/A0与A1′/A1相差较大，即偏差大于20％，则表明掺杂了除特征性肽段代表的成分以外的其他动物成分。在本专利技术所述的方法中，所述的动物胶为阿胶、马皮胶、黄明胶、羊皮胶、龟甲胶、鹿角胶、鳖甲胶或新阿胶中的其中一种或其任意组合。在本专利技术所述的方法中，优选的，在用液质联用仪进行检测时，设置共有多肽的检测离子对为m/z730.8→594.3、m/z730.8→1090.6。更进一步的，基于上述共有多肽本专利技术还提出了一种检测动物胶中动物成分含量的方法，即将共有多肽作为内标物进行含量计算，从而抵消不同生产工艺的破坏程度不同，使含量测定更加准确，所述共有多肽的氨基酸序列如SEQIDNO.1所示。所述的动物胶为阿胶、马皮胶、黄明胶、羊皮胶、龟甲胶、鹿角胶、鳖甲胶或新阿胶。附图说明图1为纯品胶MRM扫描模式下提取共有多肽m/z730.8→594.3的质谱图；图2为阿胶及鱼明胶MRM扫描模式下提取共有多肽m/z730.8→594.3的质谱图；图3为阿胶及混合胶样品MRM扫描模式下提取共有多肽m/z730.8→594.3的质谱图；图4为阿胶及混合胶样品MRM扫描模式下提取驴特征肽m/z539.8→923.8的质谱图；图5为不同煎煮工艺条件的自制阿胶MRM扫描模式下提取共有多肽m/z730.8→594.3的质谱图；图6为不同煎煮工艺条件的自制阿胶MRM扫描模式下提取驴特征肽m/z539.8→923.8的质谱图。具体实施方式下面结合具体实施例来进一步描述本专利技术，本专利技术的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但实施例仅是范例性的，并不对本专利技术的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本专利技术的精神和范围下可以对本专利技术技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本专利技术的保护范围内。实施例1动物胶中共有多肽的检测1、材料和试剂材料：纯品胶包括阿胶、马皮胶、黄明胶、鲜阿胶、龟甲胶、鳖甲胶、鹿角胶、羊皮胶，分别用驴皮、马皮、牛皮、猪皮、龟甲、鳖甲、鹿角、羊皮经煎煮、提杂、浓缩、干燥获得。试剂：碳酸氢铵(分析纯)、胰蛋白酶(序列纯，购自中国食品药品检定研究院)。2、检测方法(1)动物胶样品酶解溶液的制备取0.10g待测样品阿胶于50ml量瓶中，加适量1％(w/w)NH4HCO3溶液，超声使样品完全溶解，用1％(w/w)NH4HCO3溶液(pH8.0)稀释至刻度，摇匀，微孔滤膜过滤，精密量取续滤液1ml加2mg/ml的胰蛋白酶溶液100μl，37℃恒温酶解12h。(2)检测取5μl酶解溶液放入液质联用仪检测。液相条件：C18反相色谱柱(2.1mm×100mm，1.8μm)，流动相A为0.1％(v/v)甲酸溶液，流动相B为乙腈，流速0.3ml/min；梯度洗脱：0→25min，流动相A95％→80％(v/v)，流动相B5％→20％(v/v)；25→40min，流动相A80％→60％(v/v)，流动相B20％→40％(v/v)。质谱条件：电喷雾正离子模式(ESI+)选择进行多反应检测(MRM)，根据2015版中国药典中阿胶鉴别项下检测方法选择m/z539.8→612.4、m/z539.8→923.8作为驴的特征性肽段成分检测，根据共有多肽(SEQIDNO.1所示)选择m/z730.8→594.3、m/z730.8→1090.6作为检测离子对。按照上述方法分别完成马皮胶、黄明胶、鲜阿胶、龟甲胶、鳖甲胶、鹿角胶以及羊皮胶中共有多肽的检测。结果见图1，由图可知，各种动物胶中均检出共有多肽的离子峰，且各纯品胶样品的共有多肽的峰面积差别不大，各样品的峰面积与样品浓度的比值偏差均在20％以内。实施例2共有多肽在动物胶真伪鉴别中的应用1、材料和试剂材料：鱼明胶(购自广东明洋明胶有限责任公司)，阿胶、黄明胶分别用驴皮、牛皮经煎煮、浓缩、提杂、干燥获得。混合胶样品由阿胶分别加入30％(w/w)鱼明胶、60％(w/w)鱼明胶、30％(w/w)黄明胶、60％(w/w)黄明胶制成含30％(w/w)鱼明胶的阿胶、含6本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种动物胶中的共有多肽，该共有多肽为驴、马、牛、猪、羊、鳖、乌龟以及鹿的胶原蛋白中所共有，所述共有多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

【技术特征摘要】
1.一种动物胶中的共有多肽，该共有多肽为驴、马、牛、猪、羊、鳖、乌龟以及鹿的胶原蛋白中所共有，所述共有多肽的氨基酸序列如SEQIDNO.1所示。2.一种鉴别动物胶中是否掺杂了鱼明胶的方法，其特征在于，包含以下步骤：1)将已知真胶样品或对照样品及待检的动物胶样品分别采用胰蛋白酶酶切后，放入液质联用仪，设置特征性肽段检测成分后，设置共有多肽作为参考物质或内标物进行检测，所述共有多肽的氨基酸序列如SEQIDNO.1所示；2)分别计算出真胶样品或对照样品中共有多肽的检测峰面积A0、特征性肽段检测峰面积A0′，真胶样品或对照样品的浓度C0，待检的动物胶样品中共有多肽的检测峰面积A1、特征性肽段检测峰面积A1′，待检的动物胶样品的浓度C1；3)判断样品检测情况：a.若A0/C0与A1/C1两者的值相当，即偏差在20％以内，则表明检测正常；b.若A0/C0与A1/C1两者的值相差较大，即偏差大于20％，且两者的特征性肽段检测...

【专利技术属性】
技术研发人员：周祥山，郝向慧，郭尚伟，段小波，田守生，嵇传良，徐云鹏，王静，史兆松，张云霞，
申请(专利权)人：东阿阿胶股份有限公司，
类型：发明
国别省市：山东;37