本发明专利技术涉及一种结合胰岛素样生长因子C结构域多肽(IGF-1C)的壳聚糖水凝胶，其具有良好的细胞相容性和生物活性。这类活性水凝胶具有可注射性，能够作为载体材料，促进干细胞对组织损伤的治疗效果。其为移植干细胞提供适宜的组织再生微环境，从而提高移植干细胞的存活率。增加干细胞在损伤区内的存活及驻留，促进移植细胞存活、增殖，减少凋亡，促进损伤部位血管新生以及功能恢复，进而提高干细胞移植治疗组织损伤的治疗效果。此外，移植后水凝胶并没有促进干细胞发生不良分化。
Injectable hydrogel incorporating IGF-1C polypeptides and its use as a carrier material to enhance the repair effect of stem cells in tissue injury
The present invention relates to a chitosan hydrogel incorporating insulin-like growth factor C domain polypeptide (IGF-1C), which has good cell compatibility and biological activity. The active hydrogels are injectable and can serve as a carrier material to promote the therapeutic effect of stem cells on tissue injuries. It provides a suitable tissue regeneration microenvironment for transplanted stem cells, thereby enhancing the survival rate of transplanted stem cells. The increase of stem cells in the damaged area of the survival and dwell, promote the survival of the transplanted cells, proliferation, apoptosis, angiogenesis and promote the recovery of parts function damage, and improve the stem cell transplantation for treatment of contusion. In addition, post transplantation hydrogels did not promote poor differentiation of stem cells.
【技术实现步骤摘要】
结合IGF-1C多肽的可注射性水凝胶及其用于载体材料增强干细胞在组织损伤中的修复效果
本专利技术属于生物医用材料领域，具体涉及一种结合IGF-1C结构域多肽的活性可注射壳聚糖水凝胶的制备方法，还涉及这类材料作为干细胞载体材料应用于组织损伤修复，增强干细胞的治疗效果.
技术介绍
以干细胞为基础的细胞疗法可以为组织损伤治疗提供前景。干细胞具有自我更新和多向分化能力，可以通过转分化、旁分泌等方式参与肾脏修复。相比于药物，干细胞治疗组织损伤的一大优势在于其多样化的治疗作用可以靶向肾脏损伤病理生理学的多种机制；内源性动员或外源性输注的干细胞归巢到受损肾脏，一方面转分化为肾脏细胞直接补充丢失的小管上皮细胞，另一方面可以发挥促进增殖、减少凋亡、促进血管新生、减少炎症和调节免疫反应等作用。但是，使用外源性干细胞治疗组织损伤的过程中，递送形式是一个挑战。直接将细胞注射到组织损伤部位，很难发生整体的整合。经脉管系统注射细胞需要避免其被其他器官俘获，而且需要细胞具有定向迁移的能力。但在之前的研究中，我们发现将干细胞直接注射到缺血损伤部位，1周后仅有～1％的细胞存活。这可能与细胞处于局部恶劣(缺血缺氧、炎症、缺乏基质保护)的损伤环境有关。最近的研究显示生物支架材料作为细胞载体在调节移植细胞在受损肾脏中的细胞命运方面体现出优势。利用生物材料释放的细胞外基质与移植细胞相互作用可以改善局部微环境，增强细胞的生物学作用，并加快组织的修复和再生。壳聚糖(CS)作为一种天然大分子化合物，具有较好的组织相容性、生物可降解性及丰富的生物学活性。以CS为基础的多种类型支架材料已经在组织工程领域显示出重要的应用价值。同时，许多研究人员重视利用递送生长因子来增加组织工程化基质的生物活性。由于蛋白具有免疫原性和生物活性丢失快的缺陷，越来越多的研究支持使用具有生物学功能的模拟活性多肽(如RGD，QK，QHREDGS)来替代生长因子(如纤维粘连蛋白、血管内皮生长因子、血管生成素-1)的功能。胰岛素样生长因子-1(IGF-1)是一种强大的促有丝分裂和细胞存活的生长因子，其被认为在调控临床肾病恢复中发挥关键作用。有趣的是，最近的研究发现C结构域(IGF-1C)是IGF-1蛋白的活性区域，并且已经证明这一多肽可以促进角膜上皮伤口愈合。从这一点上来看，将活性多肽IGF-1C修饰于大分子生物支架材料可能实现载体对移植细胞特定功能的增强，从而为组织损伤修复提供新的视角。
技术实现思路
本专利技术提供了一种壳聚糖水凝胶，其特征在于，所述壳聚糖水凝胶结合了胰岛素样生长因子C结构域多肽(IGF-1C)。本专利技术的壳聚糖水凝胶既具备壳聚糖生物材料的物理和化学性能，也具有胰岛素样生长因子C结构域多肽的生物活性。本专利技术提供了上述壳聚糖水凝胶的制备方法，其包括：(1)胰岛素样生长因子C结构域多肽通过化学反应共价键结合到壳聚糖分子上；或者，(2)胰岛素样生长因子C结构域多肽通过物理混合结合到壳聚糖中。在本专利技术的制备方法中，所述化学反应是点击化学反应和/或缩合反应。本专利技术的壳聚糖水凝胶具有不同的释放胰岛素样生长因子C结构域多肽的行为。本专利技术的壳聚糖水凝胶通过结合胰岛素样生长因子C结构域多肽方式来调控所述胰岛素样生长因子C结构域多肽的释放行为。本专利技术的壳聚糖水凝胶具有可注射性。本专利技术的壳聚糖水凝胶在制备治疗组织损伤的干细胞载体中的应用。干细胞包括：脂肪间充质干细胞、骨髓间充质干细胞、脐带间充质干细胞、胎盘间充质干细胞、尿液来源干细胞、内皮祖细胞、心脏干细胞。组织损伤包括肾脏损伤、心肌梗死以及皮肤缺损。本专利技术提供一种结合IGF-1C多肽的生物活性壳聚糖水凝胶的制备方法。1.IGF-1C结构域多肽的制备方法：(1)第一个氨基酸的C端接枝在树脂上，接载率为0.6毫摩尔/克。20％的哌啶溶于N，N’-二甲基甲酰胺(DMF)用于脱除氨基的Fmoc保护基团；(2)在缩合剂O-苯并三氮唑-四甲基脲六氟磷酸盐(BTU)和催化剂N，N-二异丙基乙胺(DIPEA)的共同作用下，下一个氨基酸的羧基与游离的氨基结合；重复以上步骤，多肽链会不断增长；(3)最后将分别将叠氮化的己酸或二元酸(丁二酸、己二酸、癸二酸)连接到多肽的氨基上；(4)用一定体积的DMF反复冲洗连有多肽的树脂(5分钟，5次)，之后再用DCM冲洗(1分钟，3次)；用三氟乙酸(TFA)处理干燥的树脂，将多肽从树脂上脱离，转移进入TFA溶液；(5)收集溶液旋干，得到浓缩溶液；用冰冻乙醚处理，离心，得到沉淀；(6)将沉淀溶于二甲基亚砜(DMSO)，使用高效液相色谱纯化得到IGF-1C，及末端带有叠氮或羧基的多肽产物IGF-1C-N3或IGF-1C-COOH。2.通过点击化学反应共价结合IGF-1C多肽的壳聚糖的制备方法：碳二亚胺碳二亚胺盐酸盐催化下冰浴中反应24小时，从而通过酰胺化反应将炔基接枝到壳聚糖分子侧基上，产物经透析纯化。第二步是通过点击化学反应将碳二亚胺盐酸盐催化下冰浴中反应24小时，从而通过酰胺化反应将炔基接枝到壳聚糖分子侧基上，产物经透析纯化。第二步是通过点击化学反应将IGF-1C-N3与炔基化壳聚糖反应，采用无水硫酸铜、抗坏血酸钠做催化剂，恒温37℃搅拌反应24小时，产物经水透析3天，冷冻干燥得CS-IGF-1C。3.通过缩合反应共价结合IGF-1C多肽的壳聚糖的制备方法：碳二亚胺碳二亚胺盐酸盐催化下冰浴中反应24小时，从而通过酰胺化反应将炔基接枝到壳聚糖分子侧基上，产物经透析纯化。碳二亚胺盐酸盐催化下冰浴中反应24小时，从而通过酰胺化反应将炔基接枝到壳聚糖分子侧基上，产物经透析纯化。4.共价结合IGF-1C的壳聚糖水凝胶的制备：(1)将CS-IGF-1C以一定浓度(质量体积分数1-5％)溶解在水中；(2)β-甘油磷酸钠(β-GP)溶液滴加到壳聚糖溶液中，冰水浴条件下搅拌0.5小时；(3)混合溶液转移至37℃恒温箱中，即可见凝胶化；(4)混合溶液中β-GP终浓度为0.005-0.05M。5.物理混合IGF-1C的壳聚糖水凝胶的制备：(1)将壳聚糖以一定浓度(质量体积分数1-5％)溶解到醋酸(1-3％)溶液中，室温，过夜；(2)调节溶液pH值至中性，加入一定比例的IGF-1C多肽(多肽质量分数1-5％)，混合均匀；(3)将β-甘油磷酸钠(β-GP)溶液滴加到壳聚糖溶液中，冰水浴条件下搅拌0.5小时；(5)混合溶液转移至37℃恒温箱中，5分钟即可见凝胶化；(6)混合溶液中β-GP终浓度为0.005-0.05摩尔/升。本专利技术提供了利用结合IGF-1C多肽的活性水凝胶负载干细胞及细胞示踪的方法。1.脂肪间充质干细胞(ADSCs)提取与培养(1)准备：将手术器械(弯头镊子2把，眼科剪2把)用纱布包好灭菌，后置于烘箱中烘干；无血清培养基(PS)一管；(2)选取3～4只10周龄雄性小鼠，体重20克以上最佳，利用脱颈的方法将小鼠处死；(3)用酒精均匀喷洒小鼠腿部以及腹部毛发，用无菌的弯镊提起小鼠表皮，用无菌眼科剪小心分离小鼠皮肤和皮下肌肉组织；(4)在小鼠大腿的根部有淡粉色的脂肪组织，用剪刀仔细剥离并剪下，置于无血清培养基中暂时保存；(5)沿小鼠腹中线剪开小鼠的腹部肌肉层，打开其腹腔，在小鼠附睾附近，分布有两大块白色脂肪组织，轻轻剥本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种壳聚糖水凝胶，其特征在于，所述壳聚糖水凝胶结合了胰岛素样生长因子C结构域多肽(IGF‑1C)。
【技术特征摘要】
1.一种壳聚糖水凝胶，其特征在于，所述壳聚糖水凝胶结合了胰岛素样生长因子C结构域多肽(IGF-1C)。2.根据权利要求1所述的壳聚糖水凝胶，其特征在于，所述壳聚糖水凝胶既具备壳聚糖生物材料的物理和化学性能，也具有胰岛素样生长因子C结构域多肽的生物活性。3.根据权利要求1所述的壳聚糖水凝胶的制备方法，其包括：(1)所述胰岛素样生长因子C结构域多肽通过化学反应共价键结合到壳聚糖分子上；或者，(2)所述胰岛素样生长因子C结构域多肽通过物理混合结合到壳聚糖中。4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述化学反应是点击化学反应和/或缩合反应。5.根据权利要求1所述的壳聚糖水凝胶，其特征在于，所述壳聚糖水凝胶具有不...
【专利技术属性】
技术研发人员：赵强，李宗金，冯国伟，张计敏，孔德领，
申请(专利权)人：南开大学，
类型：发明
国别省市：天津,12
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