稳定的多肽组合物制造技术

本发明专利技术涉及稳定的多肽组合物。本发明专利技术至少部分基于开发由稳定化scFv组成或包含它的稳定化结合分子和制备这些稳定的分子的方法。

【技术实现步骤摘要】
稳定的多肽组合物本申请是申请日为2007年03月19日、中国申请号为200780017774.3、专利技术名称为“稳定的多肽组合物”的专利技术申请的分案申请。相关申请本申请要求享有以下美国临时专利申请的优先权，其每一篇为所有目的而全文纳入本文参考:I)美国临时专利申请60/783，622号，其提交于2006年3月17日，其名称为“稳定化的多肽和用于评估和增加其稳定性的方法”；2)美国临时专利申请60/812,688号，其提交于2006年6月9日，其名称为“稳定化的多肽和用于评估和增加其稳定性的方法”；3)美国临时专利申请60/873，502号，其提交于2006年12月8日，其名称为“用于评估和增强多肽生物物理性质的方法”;和4)美国临时专利申请60/873，996号，其提交于2006年12月8日，其名称为“稳定化的多肽组合物”。本说明书中引用的任何专利、专利申请、和参考文献的内容都全文纳入本文参考。
技术介绍
现在，蛋白质稳定性被认为是蛋白质(如，抗体分子)开发和升级的中心议题。抗体的重链和轻链可变区序列处在选择压力之下，其序列可在不同抗体之间有显著差别(Wu和Kabat，1970)。在人基因 组内嵌有大量功能性胚系可变重链Γ40 ；Tomlinson等，1992 ；Tomlinson 等，1994 ；Matsuda 和 Honjo, 1996)、可变 κ 链( 40 ；Meindl 等，1989 ；Cox 等，1994 ;Barbie 和 Lefranc, 1998)和可变 λ 链( 30 ;Williams 等，1996 ;Kawasaki,等，1997)基因。免疫系统产生许多重链和轻链可变区胚系组合的能力是产生抗体多样性的一种机制(Edelman, 1959 ;Fraftek, 1961)。其它多样性源自在可变区和恒定结构域之间插入可变连接肽区域——J-连接肽(加上重链的D-连接肽)(Leder，1982)。选择抗特定抗原的胚系抗体，接着，表达单一抗体(所述抗体带有所选择的可变区胚系和(D-)J-连接肽)的B细胞在可变重链和轻链结构域内进行超体细胞突变(hypersomatic)过程,从而增加针对抗原的抗体亲和性(Leder, 1982 ;Tomlinson等，1996)。在可变区内也经常可观察到超体细胞插入或缺失，然而其比超体细胞突变频率低得多(de Wildt等，1999)。因而，抗特定抗原而加以选择的成熟的抗体将具有高度独特的可变区序列，不必对其稳定性进行优化。当在多种细胞系统中(如在细菌或哺乳动物表达系统中)表达时,稳定性差可影响抗体或抗体结构域适当折叠的能力。错误折叠或稳定性不良也可导致部分非功能性材料群体(Martsev等，1998)和/或有形成大的可溶聚集体倾向的抗体,所述聚集体在用于治疗时有潜在危险或有免疫原性。其他稳定性问题包括重折叠受阻、降解、亲合性削弱、聚集，或储存后丧失活性。稳定性问题不限于天然产生的抗体，也可发生在基因工程化的抗原结合分子中，例如用于生产和临床目的的重组抗体文库(Hoogenboom，2005)、抗体片段(Holt等，2003 ；Todorovska 等，2001 ;Worn 和 Pliickthun, 2001 ;Reiter 和 Pastan, 1996)和基因工程化的或人源化的治疗性抗体(Ewert等,2004 ；Carter和Merchant, 1997)。另外，多价形式的抗体(如双特异性分子)可有稳定性的问题。尽管双特异性抗体因其能用于人的治疗所以是所希望的，但是其生产是不可预测的。例如，双特异性抗体可导致热稳定性、产品产量的实质性减少，或导致形成低分子量聚集体。在人源化啮齿动物抗体时，也可出现Vh和'结构域的非天然改变。通常将啮齿动物互补决定区(CDR)移植到最相似的人胚系可变区上来进行人源化(Hurle和Gross，1994)。被选择来进行人源化的胚系不可能以高频率地被免疫系统所使用，而且为获得足够的抗原结合性经常需要改变人框架。蛋白质不稳定会产生许多问题，包括以下的一个或多个:不适合在生物反应器中规模化生产(例如因为产量低，不需要的副产品(如未组装的产物和/或聚集材料)的水平显著高)，蛋白质难以纯化，和不适于药物制备和使用(如，由于分解产物的水平显著高、产品质量差、和/或药物动力学性质不良)。抗体、Fab、Fv、或单链Fv(ScFv)的可变区内的不稳定性可导致这些问题中的许多问题。scFv构建体尤其已显示出稳定性、溶解性、表达、聚集、分解产物、和在细菌和哺乳动物表达系统中整体可制造性的问题(参见Worn和Pluckthun, 2001)。另外，将scFv分子整合入原本稳定的重组抗体产物中，经常给新的重组设计带来这些通常不需要的特性。因此，需要预测蛋白质(如抗体)稳定性的改进方法和对于适于规模化生产的改进的稳定化抗原结合分子。也需要一些改进的方法，以规模化生产适于药物应用的稳定化的抗原结合分子群。专利技术简述本专利技术至少部分基于开发改进的多肽组合物(如改进的结合分子)和制备它们的方法，所述多肽组合物包括稳定性改善的scFv分子,或由稳定性改善的scFv分子组成。 在一个方面，本专利技术涉及稳定化的scFv分子群，其中稳定化的scFv分子包含:i)插入Vh结构域和\结构域之间的scFv接头，其中Vh和\结构域由Vh结构域中的氨基酸和\结构域中的氨基酸之间的二硫键连接，而且其中scFv分子的Vh和\结构域具有大于55° C的Tm值；或ii)插入Vh结构域和\结构域之间的scFv接头，其中乂11和\结构域由Vh中的氨基酸和\结构域中的氨基酸之间的二硫键连接，而且其中scFv分子具有大于49° C的丁50°在另一个方面，本专利技术涉及稳定化的scFv分子，其中稳定化的scFv分子包含:i) scFv接头，其具有插入Vh结构域和\结构域之间的氨基酸序列(Gly4Ser)n，其中Vh和\结构域由Vh氨基酸44位和\氨基酸100位之间的二硫键连接；ii) Vh结构域和'结构域，其中该分子具有至少一个替换，所述替换选自由如下组成的组:a)在VH的Kabat 13位上进行氨基酸替换；b)在VH的Kabat 16位上进行氨基酸替换；c)在VL的Kabat 46位上进行氨基酸替换；d)在VL的Kabat 49位上进行氨基酸替换；e)在VL的Kabat 50位上进行氨基酸替换；f)在VL的Kabat 49和50位上进行氨基酸替换；g)在VH的Kabat 101位上进行氨基酸替换；h)在VH的Kabat 20位上进行氨基酸替换；i)在VH的Kabat 48位上进行氨基酸替换；j)在VL的Kabat 3位上进行氨基酸替换；k)在VH的Kabat 55位上进行氨基酸替换；I)在VH的Kabat 67位上进行氨基酸替换；m)在VH的Kabat 6位上进行氨基酸替换；η)在VH的Kabat 32位上进行氨基酸替换；ο)在VH的Kabat 49位上进行氨基酸替换；P)在VH的Kabat 43位上进行氨基酸替换；q)在VH的Kabat 72位上进行氨基酸替换；r)在VH的Kabat 79位上进行氨基酸替换；s)在VL的Kabat 50位上进行氨基酸替换；t)在VL的Kabat 75位上进本文档来自技高网...

【技术保护点】
稳定化scFv分子群，其中所述稳定化scFv分子包含i)插入VH结构域和VL结构域之间的scFv接头，其中VH和VL结构域由VH结构域中的氨基酸和VL结构域中的氨基酸之间的二硫键连接，而且其中scFv分子的VH和VL结构域具有大于55°C的Tm值；或ii)插入VH结构域和VL结构域之间的scFv接头，其中VH和VL结构域由VH中的氨基酸和VL结构域中的氨基酸之间的二硫键连接，而且其中scFv分子具有大于49°C的T50。

【技术特征摘要】
2006.03.17 US 60/783,622;2006.06.09 US 60/812,6881.稳定化ScFv分子群,其中所述稳定化scFv分子包含 i)插入Vh结构域和\结构域之间的scFv接头，其中Vh和\结构域由Vh结构域中的氨基酸和\结构域中的氨基酸之间的二硫键连接，而且其中scFv分子的Vh和\结构域具有大于55° C的Tm值；或 )插入Vh结构域和\结构域之间的scFv接头，其中V1^P \结构域由Vh中的氨基酸和\结构域中的氨基酸之间的二硫键连接，而且其中scFv分子具有大于49° C的T5Q。2.稳定化scFv分子,其包含 i)具有插入Vh结构域和\结构域之间的氨基酸序列(Gly4Ser)n的scFv接头，其中Vh和\结构域由Vh位置44的氨基酸和\位置100的氨基酸之间的二硫键连接； ii)VH结构域和\结构域，其中该分子具有至少一个选自由如下所组成的组的替换: a)在VH的Kabat位置13上替换氨基酸； b)在VH的Kabat位置16上替换氨基酸； c)在VL的Kabat位46上替换氨基酸； d)在VL的Kabat位置49上替换氨基酸； e)在VL的Kabat位置50上替换氨基酸； f)在VL的Kabat位置49和50上替换氨基酸； g)在VH的Kabat位置101上替换氨基酸； h)在VH的Kabat位置20上替换氨基酸； i)在VH的Kabat位置48上替换氨基酸； j)在VL的Kabat位置3上替换氨基酸； k)在Kabat位置55上替换氨基酸； I)在VH的Kabat位置67上替换氨基酸； m)在VH的Kabat位置6上替换氨基酸； η)在VH的Kabat位置32上替换氨基酸； O)在VH的Kabat位置49上替换氨基酸； P)在VH的Kabat位置43上替换氨基酸； q)在VH的Kabat位置72上替换氨基酸； r)在VH的Kabat位置79上替换氨基酸； s)在VL的Kabat位置50上替换氨基酸； t)在VL的Kabat位置75上替换氨基酸； u)在VH的Kabat位置80上替换氨基酸； V)在VH的Kabat位置83上替换氨基酸；或 iii)带有位于scFv的VH和VL之间的稳定化界面的Vh结构域和\结构域，其中该分子在直接位于所述界面内的氨基酸位置上和/或在支撑VH和VL间相互作用的氨基酸位置上具有至少一个替换，其中该至少一个氨基酸位置选自由如下所组成的组:按照Kabat编号的 47H,37H,45H,46H,51H,59H,109H,14H,26H,27H,40H,69H,103H,29H,38H,44H,49H,55H,63H,54H,68H,72H,74H,79H,82bH,8H,32H,39H，41H，62H,85H，91H，24H,60H,37L,36L,44L,59L,57L,64L,46L,48L,63L,67L,68L,39L,45L,47L,54L,56L, 79L, 85L, 98L, 58L, 74L, 77L,83L，89L，和 104L,而且其中该稳定化scFv分子具有比缺少所述替换的scFv分子大的T5(l。3.稳定化多价抗原结合分子群，其中所述稳定化结合分子包含至少一个稳定化scFv分子，其包含插入Vh结构域和\结构域之间的scFv接头，其中Vh和\结构域由Vh中的氨基酸和\结构域中的氨基酸之间的二硫键连接，而且其中所述稳定化结合分子群包含单体的可溶蛋白，这种蛋白中不超过10%以聚集形式呈现。4.稳定化多价抗原结合分子群，其中每个多价抗原结合分子包含 i)至少一个scFv分子,其包含插入Vh结构域和\结构域之间的scFv接头,其中Vh和Vl结构域由Vh中的氨基酸和\结构域中的氨基酸之间的二硫键连接，而且其中至少一个scFv分子的Vh和\结构域具有大于55° C的Tm值；或 ii)至少一个scFv分子,其包含插入Vh结构域和\结构域之间的scFv接头,其中Vh和\结构...

【专利技术属性】
技术研发人员：斯蒂芬德马雷斯特，斯科特格拉泽，布赖恩R米勒，吴秀凤，威廉B斯奈德，诺曼王，莉萨J克罗纳，亚历克西A卢戈夫斯科伊，
申请(专利权)人：比奥根艾迪克MA公司，
类型：发明
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