【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】相关申请的交叉引用本申请要求申请日为2009年11月5日的美国专利申请号61/258,565的优先权,并将其内容以引用的方式并入本文。专利
本专利技术一般涉及分子生物学和蛋白质
更具体地,本专利技术涉及用于从细菌中分泌异源多肽的信号序列。本专利技术也涉及通过原核生物生产的重组多肽及其应用。专利技术背景将异源多肽分泌到大肠杆菌和其它原核生物的周质间隙或分泌到它们的培养基中受多种因素影响。一般,对用于分泌目的多肽的载体进行改造,以将编码分泌信号序列的DNA置于编码目的多肽的DNA的5’端。近年来,使用异源多肽(例如抗体)作为各种失调和疾病的诊断和治疗药剂的前景越来越好。许多研究和临床应用需要大量的功能性多肽,因此需要用于多肽生产的扩大的、但是经济的系统。特别有用的是,使用各种表达宿主,从例如大肠杆菌(E.coli)或枯草芽孢杆菌(B.subtilis)等原核生物到酵母、植物、昆虫细胞和哺乳动物细胞,通过重组体生产抗体。Kipriyanov和Little(1999)Mol.Biotech.12:173-201。与其它多肽生产体系相比,细菌,特别是大肠杆菌,具有许多独特的优点。所用的原材料(即细菌细胞)便宜且易于生长,因此降低了产品的成本。原核宿主比例如哺乳动物细胞生长更快,这使得可以对遗传操作进行更快的分析。较短的增代时间和易于扩大规模也使细菌发酵成为用于蛋白质大量生产的更具有 ...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2009.11.05 US 61/258,5651.制备抗体的方法,所述方法包括培养包含多核苷酸的宿主细胞,所述多核苷酸包括:(1)与编码抗体重链的多核苷酸有效连接的第一翻译起始区(TIR),其中该TIR包含共翻译原核分泌信号序列;和(2)与编码抗体轻链的多核苷酸有效连接的第二TIR,其中该第二TIR包含共翻译或翻译后原核分泌信号序列,由此抗体在宿主细胞中表达后,重链和轻链折叠和组装形成具生物学活性的抗体。
2.权利要求1的方法,其中第一TIR包含STII或DsbA变体信号序列。
3.权利要求2的方法,其中第一翻译起始区包含DsbA变体信号序列。
4.权利要求2的方法,其中第一翻译起始区包含SEQ ID NOs:1-10、36-39、41和42之一的序列。
5.权利要求1-4之任一的方法,其中第二翻译起始区包含STII、DsbA、MalE或PhoA变体信号序列。
6.权利要求5的方法,其中第二翻译起始区包含编码PhoA或MalE变体信号序列的多核苷酸。
7.权利要求5的方法,其中第二翻译起始区包含SEQ ID NOs.1-14、16-24、26-39和41-42之一的序列。
8.权利要求1-7之任一的方法,其中宿主细胞还包含(3)与编码Fc多肽的多核苷酸有效连接的第三翻译起始区。
9.权利要求8的方法,其中第三翻译起始区包含STII、PhoI或DsbA变体信号序列。
10.权利要求8的方法,其中第三翻译起始区包含PhoI或DsbA变体信号序列。
11.权利要求8的方法,其中第三翻译起始区包含SEQ ID NOs: 23、24、26-39、41和42之一的序列。
12.权利要求1-11之任一的方法,其中第一和第二翻译起始区提供大约相等的翻译强度。
13.权利要求12的方法,其中相对翻译强度为大约1或2。
14.权利要求8-10之任一的方法,其中第一、第二和第三翻译起始区提供大约相等的翻译强度。
15.权利要求14的方法,其中相对翻译强度为大约1或2。
16.权利要求1-15之任一的方法,其中在宿主细胞中该多核苷酸还包含启动子。
17.权利要求16的方法,其中启动子是原核启动子,其选自phoA、tac、lpp、lac-lpp、lac、ara和T7启动子。
18.权利要求1-17之任一的方法,其中宿主细胞是原核细胞。
19.权利要求18的方法,其中原核细胞是大肠杆菌。
20.权利要求19的方法,其中大肠杆菌是内源蛋白酶活性缺陷型菌株。
21.权利要求19或20的方法,其中大肠杆菌的基因型缺失degP和prc基因,并携带突变的spr基因。
22.权利要求1-21之任一的方法,其中宿主细胞还包含编码至少一个原核多肽的多核苷酸,所述原核多肽选自DsbA、DsbC、DsbG和FkpA。
23.权利要求22的方法,其中多核苷酸编码DsbA和DsbC。
24.权利要求1-23之任一的方法,其中宿主细胞包含共同编码抗体的一个或多个多核苷酸。
25.权利要求1-24之任一的方法,其中方法还包括从宿主细胞培养物中回收抗体。
26.权利要求25的方法,其中从宿主细胞培养基中回收抗体。
27.权利要求25或26的方法,其中方法还包括将所回收的抗体...
【专利技术属性】
技术研发人员:M·马里基,D·E·莱利,
申请(专利权)人:弗·哈夫曼拉罗切有限公司,
类型:
国别省市:
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