纯化活性多肽或免疫偶联物的方法技术

本发明专利技术提供了使用阴离子交换色谱法，通过纯化含有一种活性多肽或免疫偶联物以及它的一种酸性变体（例如一种脱氨酶变体）的溶液而分离该活性多肽或免疫偶联物的方法。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】专利技术背景专利
本专利技术提供了用于从包含一种多肽或免疫偶联物以及它的一种酸性变体的溶液中对该活性多肽或免疫偶联物进行纯化的方法，其中该酸性变体是所述多肽或免疫偶联物的一个脱酰胺化种类。本专利技术还提供了包含此类经纯化的多肽或免疫偶联物的配制品。
技术介绍
大规模、经济的蛋白质纯化是生物制药行业的一个因素。治疗性蛋白质典型地是使用原核或真核细胞系产生的，这些细胞系经过工程化处理以表达来自一种重组质粒的感兴趣的蛋白质，该质粒包含编码该蛋白质的基因。将所希望的蛋白质从被送至细胞的组分和细胞副产物的混合物中以达到足以用作治疗剂(例如足以用作一种人类治疗物)的纯度进行分离由于多个原因对生物制品制造商提出了严峻的挑战。基于蛋白质的药物产物的制造商必须遵守严格的监管标准，包括极为严格的纯度要求。为了确保安全性，监管机构(例如美国食品与药品监督管理局(FDA))要求基于蛋白质的药物产品基本上不含杂质，包括与产品相关的污染物(例如聚集体)、该重组蛋白的片段和变体以及与过程相关的污染物(例如宿主细胞蛋白、培养基组分、病毒、DNA以及外毒素)。尽管在生物制药行业可以获得并广泛使用不同的蛋白纯化方案，但他们典型地包括一个亲和纯化步骤，例如对于抗体而言进行蛋白A纯化，以便达到药学可接受的纯度。形成一个可适用于某一特定生物分子或不同生物分子的纯化方案(该方案是成规模的、可控的、并且在策略上采用了特定树脂或树脂组合的用途)应当允许它在整个药物形成过程中的非常早期的阶段整合至产品形成过程中。设计一种纯化方案的方法能够将制造过程的昂贵费用变化最小化，否则这可能随后在药物发展中是必需的或在批准之后情况更坏。随着该过程成规模并且达到GMP生产条件，额外的固有复杂问题即产生，包括与树脂包装和缓冲液制备有关的复杂问题。制造过程及其能力可通过以下方式改进简化纯化方案、取消过程步骤并且将产出和生产率最大化，同时维持正在纯化的分子的完整性和纯度。因此，令人希望的并且有利的是以一个简单并且有效的过程起始，该过程能产生一种具有高质量和高安全性的药物物质。与药物产品的纯化相关的一个复杂问题是在整个纯化过程中维持效力。很多因素能造成效力的降低或抑制，包括在发展过程中药物产品的修饰。这种修饰能在该过程的各个阶段发生，例如当该蛋白质在细胞中表达时、或当已经从细胞中分离的蛋白质经受各种条件或缓冲液时。本专利技术提供了一种用于从包含多肽或偶联物的经修饰的变体的溶液纯化该活性多肽或免疫偶联物的方法，其中这种经修饰的变体的存在导致了最终药物产品效力的抑制。专利技术概述本专利技术提供了一种用于从包含多肽以及一种酸性变体(例如一种脱酰胺化的变体)的溶液中纯化感兴趣的多肽的方法。具体而言，本专利技术提供了一种用于纯化活性免疫偶联物的方法，其中该免疫偶联物在一个或多个残基上脱酰胺化，并且其中这种脱酰胺化作用导致所述免疫偶联物效力的抑制，该方法包括:(a)将该免疫偶联物与一种阴离子交换AIEX色谱基质相接触；并且(b)用一种高盐缓冲液将该结合的免疫偶联物从该AIEX色谱基质洗脱，从而将该活性偶联物与该脱酰胺化的变体分离。本专利技术还提供了一种用于从包含多肽以及该多肽的一种酸性变体的溶液中产生经纯化的多肽的方法，其中该多肽的酸性变体导致了该多肽效力的抑制，该方法包括:(a)将该多肽与一种阴离子交换(AIEX)色谱基质相接触，并且(b)用一种高盐缓冲液将该结合的多肽从该AIEX色谱基质洗脱，从而将所述多肽与该酸性变体分开并且产生一种经纯化的多肽。本专利技术进一步提供了一种从含该肽以及该多肽的一种酸性变体的溶液中产生经纯化的多肽或免疫偶联物的方法，该方法包括:(a)在一种表达该多肽或免疫偶联物的细菌细胞中产生该多肽或免疫偶联物；(b)将包含多肽或免疫偶联物的包涵体从这些细菌细胞分离；(C)将从这些包涵体分离的多肽或免疫偶联物再折叠；(d)将包含该多肽或免疫偶联物的组合物与一种AIEX色谱基质相接触；并且(b)用一种高盐缓冲液将该结合的多肽或免疫偶联物从该AIEX色谱基质洗脱，从而将该多肽或免疫偶联物从该溶液中纯化。在某些实施方案中，该酸性变体是一种脱酰胺化的变体。在其他实施方案中，在纯化过程中该酸性或脱酰胺化变体的约75%至约99%之间被去除，尤其是约75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98% 或 99%。本专利技术的AIEX基质包含季胺或叔胺的离子交换基团，一个季氨(Q)基团，在某些实施方案中，该AIEX基质是Q琼脂糖凝胶。本专利技术的多肽或免疫偶联物用线性或阶梯式盐梯度洗脱。在某些实施方案中，该线性盐梯度是从约Tris/HCl、pH8.0中的150mM NaCl至Tris/HCl、pH8.0中的约300mMNaCl，从 Tris/HCl、ρΗ8.0 中的约 175mMNaCl 至 Tris/HCl、ρΗ8.0 中的约 275mM NaCl，或从Tris/HCl、pH8.0 中的约 192mM NaCl 至 Tris/HCl、pH8.0 中的约 245mM NaCl。在一个实施方案中，本专利技术的多肽或免疫偶联物包括一种抗体或它的抗原结合片段，其中该该抗体或抗原结合片段包括一个Fab、Fab’、F(ab’)2、Fd、单链Fv或scFv、双硫化物连接的Fv、V NAR结合域、IgNar、内抗体(intrabody)、IgG CH2、迷你抗体、F (ab’)3、四体抗体(tetrabody)、三体抗体(triabody)、双体抗体(diabody)、单一结构域抗体、DVD_Ig、Fcab、mAb2、a(scFv) 2、或scFv_Fc。在一些实施方案中，该抗体或抗原结合片段结合一种细胞表面受体，例如该细胞表面受体是CD22。在其他实施方案中，该抗体或它的抗原结合片段包括一个VH和VL序列，其中该VH序列选自下组，该组由以下各项组成:SEQ ID N0:6至11，并且该VL序列选自下组，该组由以下各项组成:SEQ ID N0:2以及12至15。在另一个实施方案中，该多肽或免疫偶联物包括一种毒素，其中该毒素选自下组，该组由以下各项组成:绿脓杆菌外毒素、蓖麻毒素、相思豆毒素、白喉毒素以及它们的亚单位，连同肉毒杆菌毒素A至F或变体、或它们的衍生物。在一些实施方案中，该绿脓杆菌外毒素或它的变体具有一个氨基酸序列，该序列选自下组，该组由以下各项组成:SEQ ID NO: 16至22。在一个特定的实施方案中，该免疫偶联物是包括SEQ ID NO:1的VH-PE38亚单位以及SEQ ID NO:2的VL亚单位的CAT-8015免疫毒素。本专利技术还提供了一种组合物，该组合物包括一种具有小于约25%与约1%之间的脱酰胺化种类的经纯化的免疫偶联物，其中所述免疫偶联物通过以上所说明的任意一种方法纯化。该组合物可以存在小于约25%、20%、15%、10%、5%、4%、3%、2%、或1%的该脱酰胺化种类。在某些实施方案中，该组合物是一种药物组合物，它包括一种经纯化的多肽或免疫偶联物以及一种药学上可接受的载体。本专利技术还提供一种配制品，该配制品包括25mM磷酸钠、4%蔗糖、8%甘氨酸、O. 02%聚山梨酸酯80 (PS80)、pH7. 4中的lmg/mL CAT-8015。在其他实施方案中，该配制品被冷冻干燥。本专利技术还提供了一种本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2010.07.30 US 61/369,1481.一种纯化活性免疫偶联物的方法，其中所述免疫偶联物在一个或多个残基上被脱酰胺化，并且其中所述脱酰胺化作用导致了所述免疫偶联物效力的抑制，该方法包括:(a)将该免疫偶联物与一种阴离子交换AIEX色谱基质相接触；并且(b)用一种高盐缓冲液将该结合的免疫偶联物从该AIEX色谱基质洗脱，从而将该活性免疫偶联物与该脱酰胺化的变体分离。2.一种用于从包含多肽以及该多肽的酸性变体的溶液产生经纯化的多肽的方法，其中该多肽的所述酸性变体导致了所述多肽效力的抑制，该方法包括:(a)将该多肽与一种阴离子交换(AIEX)色谱基质相接触，并且(b)用一种高盐缓冲液该所结合的多肽从该AIEX色谱基质洗脱，从而将所述多肽与该酸性变体分离并且产生一种经纯化的多肽。3.一种用于从包含多肽以及该多肽的酸性变体的溶液中产生经纯化的多肽或免疫偶联物的方法，该方 法包括:(a)在一种表达多肽或免疫偶联物的细菌细胞中产生该多肽或免疫偶联物；(b)将包·含该多肽或免疫偶联物的包涵体从这些细菌细胞分离；(c)将从这些包涵体分离的多肽或免疫偶联物再折叠；(d)将包含该多肽或免疫偶联物的组合物与一种AIEX色谱基质相接触；并且(b)用一种高盐缓冲液将该结合的多肽或免疫偶联物从该AIEX色谱基质洗脱，从而将该多肽或免疫偶联物从该溶液纯化。·3.如权利要求2或3所述的方法，其中该酸性变体是一种脱酰胺化的变体。4.如权利要求1至3中任一项所述的方法，其中该AIEX基质包含季胺以及叔铵的离子交换基团。5.如权利要求4所述的方法，其中该AIEX基质包含一种季氨(Q)基团。6.如权利要求5所述的方法，其中该AIEX基质是Q琼脂糖凝胶。7.如权利要求1至6中任一项所述的方法，其中该多肽用一种线性或阶梯式的盐梯度洗脱。8.如权利要求7所述的方法，其中该多肽用一种线性盐梯度洗脱。9.如权利要求8所述的方法，其中该线性盐梯度是从约Tris/HCl、pH8.0中的150mMNaCl 至约 Tris/HCl、pH8.0 中的 300mM NaCl。10.如权利要求9所述的方法，其中该线性盐梯度是从约Tris/HCl、pH8.0中的175mMNaCl 至约 Tris/HCl、pH8.0 中的 275mM NaCl。11.如权利要求9所述的方法，其中该线性盐梯度是从约Tris/HCl、pH8.0中的192mMNaCl 至约 Tris/HCl、pH8.0 中的 245mM NaCl。12.如权利要求1至11中任一项所述的方法，其中该酸性或脱酰胺化变体的约75%至约99%被去除。13.如权利要求12所述的方法，其中该酸性或脱酰胺化变体的约80%被去除。14.如权利要求12所述的方法，其中该酸性或脱酰胺化变体的约85%被去除。15.如权利要求12所述的方法，其中该酸性或脱酰胺化变体的约90%被去除。16.如权利要求12所述的方法，其中该酸性或脱酰胺化变体的约95%被去除。17.如权利要求12所述的方法，其中该酸性或脱酰胺化变体的约96%、97%、98%或99%被去除。18.如权利要求1至17中任一项所述的方法，其中该多肽或免疫偶联物包括一种抗体或其抗原结合片段。19.如权利要求18所述的方法，其中该抗体或抗原结合片段包括一个Fab、Fab’、F (ab') 2、Fd、单链Fv或scFv、双硫化物连接的Fv、V_NAR结构域、IgNar、内抗体、IgG Δ CH2、迷你抗体、F{ah' ) 3、四体抗体、三体抗体、双体抗体、单一结构域抗体、DVD-1g、Fcab、mAb2、a(scFv)2、或 scFv-Fc。20.如权利要求18或19所述的方法，其中该抗体或抗原结合片段结合了一种细胞表面受体。21.如权利要求20所述的方法，其中该细胞表面受体是CD22。22.如权利要求1至21中任一项所述的方法，其中该多肽或免疫偶联物包括一种毒素。23.如权利要求22所述的方法，其中该毒素选自下组，该组由以下各项组成:绿脓杆菌外毒素、蓖麻毒素、相思豆毒素、白喉毒素以及它们的亚单位，连同肉毒杆菌毒素A至F或变体、或它们的衍生物。24.如权利要求22或23所述的方法，其中该毒素是一种绿脓杆菌外毒素、或它的变...

【专利技术属性】
技术研发人员：T·林克，W·K·王，A·夏，H·萨瑟斯，A·亨德，C·汤普森，
申请(专利权)人：米迪缪尼有限公司，
类型：
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