白细胞介素-10多肽结合物和其用途制造技术

本发明专利技术涉及白细胞介素-10(IL-10)多肽结合物，其包含至少一个非天然编码氨基酸。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及白细胞介素-10 (interleukin-io ;IL-10)多肽结合物，其包含至少一 个非天然编码氨基酸。
技术介绍
白细胞介素-10是一种细胞因子（cytokine)，其原先特征在于其抑制Thl细胞因 子产生的活性。参见例如，德·弗里斯（de Vries)和德?瓦尔?梅勒菲特（de Waal Malefyt) (编，1995)白细胞介素-10兰德斯公司（Landes Co.)，德克萨斯州奥斯汀（Austin, Tex.); 等。 免疫功能的抑制用于许多不同情况下。参见例如保罗（Paul)(编，1995)基本免 疫学第 3 版（Fundamental Immunology 3d ed·)，雷文出版社（Raven Press),纽约（NY)。 具体来说，同种异体免疫很大程度上因其非凡力量而在移植情况下至关重要。随着器官和 组织移植在医学情况下变得更常见，将来自组织排斥反应的问题减到最少的能力展现更大 的经济优势。另外，将自体免疫性病状减到最少、阻断对颗粒性抗原（例如细菌和寄生虫） 的某些响应和将对某些可溶性抗原（蛋白质和过敏原两者）的反应减到最少的手段将表示 显著的治疗学进展。 缺乏将组织排斥反应、移植对宿主疾病或其它免疫响应减到最少或消除的完全有 效治疗剂导致许多问题。本专利技术阐述许多这些问题并提供其解决方案。 尽管白细胞介素-IO(IL-IO)通常已经被认为是有利于肿瘤逃避免疫监视的消 炎、免疫抑制性细胞因子，累积的迹象显示IL-10也具有一些免疫刺激特性。实际上，IL-10 具有在不同实验模型中正面和负面地影响固有和适应性免疫功能的多效性能力。 IL-10在身体中的血清半衰期相对较短。举例来说，通过体外生物分析或通过败 血性休克模型系统中功效所测量的小鼠中半衰期[参见史密斯（Smith)等人，细胞免疫学 (Cellular Immunology) 173:207214(1996)]是约 2 到 6 小时。 蛋白质的聚乙二醇化可以通过延迟肾清除率来延长其血清半衰期，因为PEG部分 使蛋白质的流体动力学半径大量增加。然而，常规聚乙二醇化方法是针对单体蛋白质和更 大的二硫键接复合物（例如单克隆抗体）。IL-10的聚乙二醇化呈现此项技术中已知的其 它聚乙二醇化蛋白质未遇到的问题，因为IL-10二聚物通过非共价相互作用保持在一起。 在聚乙二醇化期间可能增加的IL-10解离将导致聚乙二醇化的IL-10单体（PEG-IL-10单 体）。PEG-IL-10单体不保持IL-10的生物活性。还注意到二-PEG-IL-10,亦即在IL-10的 两个氨基酸残基上聚乙二醇化不保持明显体外生物活性。在保持生物活性或甚至提供生物 活性增强或调节的治疗中使用一或多种IL-10多肽将是优势。本专利技术阐述这一点和此项技 术中的其它相关需要。 癌症和肿瘤可以受到免疫系统控制或根除。免疫系统包括若干类型的淋巴和骨 髓细胞，例如单核细胞、巨噬细胞、树突状细胞（DC)、嗜酸性细胞、T细胞、B细胞和嗜中性 白细胞。这些淋巴和骨髓细胞产生被称为细胞因子的分泌性信号传导蛋白质。细胞因子 包括例如白细胞介素-IO(IL-IO)、干扰素-Y(IFN. Y.)、IL-12和IL-23。免疫响应包括 炎症，亦即免疫细胞全身性地或在身体特定位置中的累积。响应于感染剂或外来物质，免 疫细胞分泌细胞因子，所述细胞因子随后调节免疫细胞增殖、发育、分化或迁移。免疫响应 过度可能产生病理性结果（例如自身免疫病症），而免疫响应削弱可能导致癌症。免疫系 统的抗肿瘤响应包括例如由巨噬细胞、NK细胞和嗜中性白细胞介导的固有免疫和例如由 抗原呈递细胞（APC)、T细胞和B细胞介导的适应性免疫（参见例如阿巴斯（Abbas)等人 (编）（2000)细胞和分子免疫学（Cellular and Molecular Immunology)，W.B.桑德斯公 司（W.B. Saunders Co·),宾夕法尼亚州费城（Philadelphia, Pa.);奥本海姆（Oppenheim) 和费尔德曼（Feldmann)(编）（2001)细胞因子参考文献（Cytokine Reference),学术出版 社（Academic Press),加利福尼亚州圣地亚哥（San Diego, Calif.);冯?安德里安（von Andrian)和麦基（Mackay) (2000)新英格兰医学杂志（New Engl. J. Med. )343:1020-1034; 戴维森（Davidson)和戴蒙德（Diamond) (2001)新英格兰医学杂志345:340-350)。 调节免疫响应的方法已经用于治疗癌症，例如黑色素瘤。这些方法包括用细胞 因子（例如IL-2、IL-10、IL-12、肿瘤坏死因子-a (TNFa)、IFN. 、粒细胞巨噬细胞菌 落刺激因子（GM-CSF)和转型生长因子（TGF))治疗或用细胞因子拮抗剂（例如抗体）治 疗。白细胞介素-10首先被描述为细胞因子合成抑制性因子（CSIF;参见例如菲奥伦蒂诺 (Fiorentino)等人（1989)实验医学杂志（J.Exp. Med. ) 170:2081-2095)。IL-10 是由 T 细胞、B细胞、单核细胞产生的多效性细胞因子，其可以充当免疫抑制剂和免疫刺激剂两者 (参见例如格鲁士（Groux)等人（1998)免疫学杂志（J. Immunol. ) 160:3188-3193 ;和海根 保尔（Hagenbaugh)等人（1997)实验医学杂志 185:2101-2110)。 共价连接亲水性聚合物聚（乙二醇）（缩写为PEG)是一种提高许多生物活性分子 (包括蛋白质、肽，尤其是疏水性分子）的水溶性、生物利用率；延长血清半衰期；延长治疗 半衰期；调节免疫原性；调节生物活性；或延长循环时间的方法。PEG已被广泛用于医药品 或人工移植物以及生物相容性、无毒和无免疫原性极为重要的其它应用中。 PEG衍生物常常是通过反应性化学官能团（例如赖氨酸、半胱氨酸和组氨酸残基、 N端和碳水化合物部分）与生物活性分子连接。蛋白质和其它分子常常具有少数反应性位 点可供聚合物连接。最适合于通过聚合物连接而修饰的位点常常在受体结合中起到重要作 用，并且是保留分子的生物活性所必需的。因此，聚合物链与生物学活性分子上所述反应性 位点的任意连接常常导致经聚合物修饰的分子的生物活性明显减少或甚至全部丧失。R.克 拉克（R. Clark)等人，(1996),牛物化学杂志（T. Biol. Chem.), 271:21969-21977。为了形 成聚合物分子量足够赋予目标分子所需优点的结合物，现有技术方法通常涉及大量聚合物 臂与分子的无规连接，由此增加母体分子的生物活性减少或甚至完全丧失的风险。 形成PEG衍生物与蛋白质的连接点的反应性位点可由蛋白质的结构指示。蛋白质 (包括酶）由各种序列的α -氨基酸构成，其具有通式结构H2N--CHR-C00H。一个氨基酸 的α-氨基部分（H2N--)与相邻氨基酸的羧基部分（一C00H)接合形成酰胺键，其可以表示 为--(NH-CHR--C0) 本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种白细胞介素10(IL‑10)多肽，其包含一或多个非天然编码氨基酸。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2012.02.29 US 61/605,1251. 一种白细胞介素 IO(IL-IO)多肽，其包含一或多个非天然编码氨基酸。2. 根据权利要求1所述的IL-10,其中所述IL-10多肽与SEQ ID NO: 390%同源。3. 根据权利要求1所述的IL-10,其中所述IL-10多肽与SEQ ID NO: 3至少90%同源。4. 根据权利要求1所述的IL-10,其中所述IL-10多肽与SEQ ID NO: 3至少95%同源。5. 根据权利要求1所述的IL-10,其中所述IL-10多肽与SEQ ID NO: 3至少98%同源。6. 根据权利要求1所述的IL-10,其中所述IL-10多肽与SEQ ID NO: 3至少99%同源。7. 根据权利要求1所述的IL-10,其中所述IL-10结合于一或多种水溶性聚合物上。8. 根据权利要求3所述的IL-10,其中所述水溶性聚合物中的至少一者与非天然编码 氨基酸中的至少一者连接。9. 根据权利要求1所述的IL-10,其中所述IL-10的形式是单体。10. 根据权利要求1所述的IL-10,其中所述IL-10的形式是二聚物。11. 根据权利要求9所述的IL-10,其中所述IL-10三聚物结合于至少一种水溶性聚合 物上。12. 根据权利要求10所述的IL-10,其中所述IL-10三聚物结合于至少一种水溶性聚 合物上。13. 根据权利要求1所述的IL-10,其中所述非天然编码氨基酸在选自由以下残基组 成的群组的位置处经取代：位置1之前（亦即在N端）、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、 14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、 39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、 64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、 89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、 111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、 130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、 149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160 或添加到蛋白质羧基端上和其任何 组合。14. 根据权利要求1所述的IL-10,其中所述IL-10包含一或多个调节所述IL-10多肽 对IL-10受体亲和力的氨基酸取代、添加或缺失。15. 根据权利要求1所述的IL-10,其中所述IL-10包含一或多个提高所述IL-10稳定 性或溶解性的氨基酸取代、添加或缺失。16. 根据权利要求1所述的脂蛋白元，其中所述IL-10包含一或多个提高所述IL-10多 肽在重组宿主细胞中的表达或体外合成的氨基酸取代、添加或缺失。17. 根据权利要求1所述的IL-10,其中所述IL-10包含一或多个提高所述IL-10的蛋 白酶抗性的氨基酸取代、添加或缺失。18. 根据权利要求1所述的IL-10,其中所述非天然编码氨基酸对连接基团、聚合物或 生物活性分子具有反应性，而所述连接基团、聚合物或生物活性分子另外对所述多肽中的 20种常见氨基酸中的任一者均不具反应性。19. 根据权利要求1所述的IL-10,其中所述非天然编码氨基酸包含羰基、氨氧基、肼 基、醜餅基、氣基脈基、置氣基或块基。20. 根据权利要求19所述的IL-10,其中所述非天然编码氨基酸包含羰基。21. 根据权利要求1所述的IL-10,其中所述非天然编码氨基酸具有以下结构：其中η是O到10成是烷基、芳基、经取代烷基或经取代芳基；R2是H、烷基、芳基、经取 代烷基和经取代芳基；并且R3是1氨基酸、多肽，或氨基端修饰基团；并且R4是!1、氨基酸、 多肽，或羧基端修饰基团。22. 根据权利要求19所述的IL-10,其中所述非天然编码氨基酸包含氨氧基。23. 根据权利要求19所述的IL-10,其中所述非天然编码氨基酸包含酰肼基。24. 根据权利要求19所述的IL-10,其中所述非天然编码氨基酸包含肼基。2...

【专利技术属性】
技术研发人员：克里斯汀·S·艾顿，梅兰妮·尼尔森，
申请(专利权)人：AMBRX公司，
类型：发明
国别省市：美国;US