一种抗肿瘤多肽及其制备方法和用途技术

本发明专利技术公开了一种抗肿瘤多肽及其制备方法和用途，该多肽与谷氨酰转肽酶(γ‑GGT)蛋白的片段第7～19位氨基酸残基完全匹配，其氨基酸序列如下：VLGLLAVVLVLVI，命名为VI‑13。为改善其溶解性，将其序列改构：VLGLRLAVRVLRVLRVI，命名为VI‑17。本发明专利技术涉及的多肽是通过固相合成方法获得的。体内外药效学实验结果表明，本发明专利技术的多肽可显著抑制人肝癌细胞系Hep3B的生长，具有潜在的抗肿瘤药物开发价值。

【技术实现步骤摘要】
一种抗肿瘤多肽及其制备方法和用途
本专利技术属于生物医学
，具体涉及一种多肽的筛选、合成及其应用，本专利技术的多肽具有抗肿瘤活性。
技术介绍
肿瘤仍是威胁人类健康的重要因素，每年约有700万人死于肿瘤相关疾病。虽然手术和化疗能在一定程度上控制病情，但往往不能彻底清除肿瘤细胞，仍有大量病人发生复发和转移。目前，化疗是阻断肿瘤病情进展的最常用手段。但传统的化疗手段暴露出大量弊端，如特异性差、易出现耐药性、药物体内分布差异和药物清除率等。因此，针对肿瘤的高特异性靶向性药物的研发悄然兴起。长期以来，人们希望通过对肿瘤相关蛋白/多肽及其受体的研究，从而开发出具有高效率和高选择性的抗肿瘤药物，目前这一类制剂包括肿瘤相关蛋白、单克隆抗体和多肽。但由于蛋白和单克隆抗体的分子量较大，不易直接作用到肿瘤组织，且两者都具有一定的肝脏和骨髓毒性，使其应用受到了极大的限制。与前者相比，多肽药物由于其免疫原性低、受体结合率高、制备成本低且易于改造和联合应用，逐渐受到肿瘤治疗领域的关注。虽然多肽的体内半衰期短，易被蛋白酶降解和肝肾等脏器代谢，但凭借其治疗的高效性和特异性，目前已有多种多肽类药物及其衍生物上市或进入临床研究阶段，其中抗肿瘤药物有10余种已批准上市。抗肿瘤多肽的来源主要有以下几种：1.天然来源的抗肿瘤多肽，主要从动物、植物和海洋生物体内分离得到，如来源于牛科动物的乳铁蛋白LfcinB9肽LTX-302、植物中分离出的新肽psylesA-F等都能针对多种肿瘤发挥抗肿瘤活性；2.肽库来源的抗肿瘤多肽，其中多数是通过噬菌体展示库和化学合成肽库中筛选得到，如噬菌体展示库中筛选到的CD133特异性结合7肽LS-7能有效抑制结肠癌、乳腺癌等肿瘤细胞的迁移和转移，人工化学合成多肽如TZT-1027可抑制微管蛋白聚合，使细胞从G2/M期阻滞，促使细胞凋亡。虽然目前抗肿瘤多肽的研究已取得不错的成绩，但几乎所有的多肽均来源与自然界或是化学合成库，从人体中分离得到的抗肿瘤多肽鲜有报道，这些多肽可能具有一定的潜在免疫排异反应可能。因此，研究和开发人源性的抗肿瘤多肽将具有更高的特异性和安全性。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种抗肿瘤多肽及其制备方法和应用，该抗肿瘤多肽具有显著抑制肿瘤细胞活性的生物学效应多肽，具有潜在的抗肿瘤药物开发价值。本专利技术的技术方案是：一种多肽VI-13，其特征是氨基酸序列如SEQID：No.1所示。一种多肽VI-17，其特征是氨基酸序列如SEQID：No.2所示。一种多肽VI-17，其特征是相关衍生多肽AI-17的氨基酸序列如SEQID：No.3所示。一种多肽VI-17，其特征是相关衍生多肽IV-17的氨基酸序列如SEQID：No.4所示。一种多肽VI-17，其特征是相关衍生多肽VI-7的氨基酸序列如SEQID：No.5所示。一种多肽VI-17，其特征在于该多肽为具有显著抑制肿瘤细胞活性的生物学效应多肽。一种多肽VI-17，其特征在于该多肽为具有胞浆定位的多肽。一种多肽VI-17，其特征在于在制备抗肿瘤药物中的应用。该抗肿瘤多肽与谷氨酰转肽酶(γ-GGT)蛋白的片段第7～19位氨基酸残基完全匹配，其氨基酸序列如下：VLGLLAVVLVLVI，命名为VI-13。为改善其溶解性，将其序列改构：VLGLRLAVRVLRVLRVI，命名为VI-17。本专利技术人通过对脐带血清高效色谱筛选和MALDI-TOFMS质谱检测，鉴定了γ-GGTN端多肽片段VI-13，其序列如SEQID：No.1所示。根据VI-13的序列特征和溶解性进行改构得到VI-17，其序列如SEQID：No.2所示，采用固相化学合成法获得具有较高抗肿瘤活性的目标多肽。其相关衍生多肽：药效学实验表明，多肽VI-17体内外显著抑制人肝癌细胞Hep3b的生长，表明VI-17可能作为一种抗肿瘤治疗的药物。根据本专利技术，所说的“多肽片段VI-17”也包括本领域技术人员所知的将SEQIDNo.2序列中的氨基酸经过一个或多个氨基酸残基的取代或添加且具有相同酶活性的由其衍生的多肽或蛋白质，比如在C末端和/或N末端添加一个或数个氨基酸，如与载体编码的氨基酸融合、前导序列、分泌序列或用来纯化此多肽的序列或蛋白原序列等；一个或多个保守性氨基酸残基被取代；或成熟多肽与另一化合物(比如延长多肽半衰期的化合物，如聚乙二醇)融合所形成的多肽；也可以是一个或氨基酸残基中具有取代基团的多肽。其次，本专利技术还提供上述多肽片段的活性区域的核心部分，其序列如SEQIDNo.3所示。附图说明图1是脐带血的体积排阻色谱(SEC)筛选结果。图2是目标分子的质谱鉴定结果。图3是多肽生物学活性的MTT检测结果。图4是裸鼠荷瘤实验体内验证多肽的抗肿瘤特性。图5是流式检测肿瘤细胞死亡。具体实施方式一、多肽筛选和改构血清样品的制备：收集胎儿脐带血清约5ml，室温下静置30分钟后，4℃低温保存4小时后离心(2000r/min、10min)，吸取上层血清置于-80℃保存待用。二维色谱：体积排阻色谱(SEC):将血清样品用PBS(pH7.4)稀释10倍，每次进样100μl。流动相为20mmol·L-1KH2PO4+100mmol·L-1NaCl，pH＝7.0，流速0.5ml·min-1。用紫外检测仪在280nm进行检测。按照色谱洗脱曲线进行分段收集，由于SEC分离主要取决于被分离分子的大小，因此血清中第一段组分主要为血清中大分子量蛋白质。本研究主要收集160min-180min和200min-220min后两段组分，将收集的色谱组分浓缩冻干，见附图1。反相液相色谱(RPLC)：用150μl超纯水融解浓缩冻干的色谱组分。取100μl用C18大孔反相液相色谱柱分离，以CH3OH-H2O-1‰三氟乙酸(TFA)体系为流动相，A液为H2O+1‰TFA，B液为CH3OH+1‰TFA，30min线形梯度洗脱从100％A到100％B，后延长15min。按照色谱洗脱曲线进行分段收集反向液相色谱相关产物，进行质谱鉴定，于质核比2021处检测到特异性峰，见附图2。经测序和生物信息学分析，确定该序列为VLGLLAVVLVLVI。二、多肽合成本专利技术多肽均为固相化学合成法获得，具体步骤如下：多肽固相合成顺序一般从C端(羧基端)向N端(氨基端)进行。以Fmoc-Ile-wangregin树脂为载体,用DCM膨胀后树脂体积扩大，使其在后面的反应中能和反应溶剂充分接触；在六氢吡啶DMF溶液的作用下，脱掉氨基的保护基，使第一个氨基酸Fmoc-Ala-OH接到固相载体上。然后氨基被封闭的第二个氨基酸的羧基通过N,Nˊ-二环己基碳二亚胺(DCC，Dicyclohexylcarbodiimide)活化，羧基活化后的的第二个氨基酸再与已接在固相载体的第一个氨基酸的氨基反应形成肽键，在固相载体上就生成一个带有保护基的二肽。依次重复上面的反应步骤，使肽链从C端向N端延长，直至达到所需要的肽链长度，最后N端合成Fmoc-Ala-OH。反应完成后在六氢吡啶DMF溶液的作用下，脱掉氨基的保护基，最后再次使用DCM膨胀两次，用乙醚或者甲醇收缩干燥后下肽。三、生物学效应1、VI-17在体外对肝癌细胞系Hep3b生长的影响。细胞活力检测：用含10％胎牛血清的DMEM培养Hep3本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种多肽VI‑13，其特征是氨基酸序列如SEQ ID：No.1所示。

【技术特征摘要】
1.一种多肽VI-13，其特征是氨基酸序列如SEQID：No.1所示。2.一种多肽VI-17，其特征是氨基酸序列如SEQID：No.2所示。3.根据权利要求书2所述的一种多肽VI-17，其特征是相关衍生多肽AI-17的氨基酸序列如SEQID：No.3所示。4.根据权利要求书2所述的一种多肽VI-17，其特征是相关衍生多肽IV-17的氨基酸序列如SEQID：No.4所示。5.根...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈勇，白泉，姚雪彪，赵宁，方诚，郭欣，吕行，殷若哲，乔勃伟，李雯慧，宋文杰，何勇，杨雁灵，
申请(专利权)人：陈勇，
类型：发明
国别省市：陕西,61