与激活型肝星状细胞特异性结合的多肽及制备方法和应用技术

本发明专利技术公开了一种与激活型肝星状细胞特异性结合的多肽，所述多肽的氨基酸序列为Thr‑Val‑Arg‑Thr‑Ser‑Ala‑Asp。还公开了其制备方法和应用。本发明专利技术提供的一种与激活型肝星状细胞特异性结合的多肽，能够与激活型肝星状细胞进行特异性结合，亲和力高。本发明专利技术的制备方法以静止型肝星状细胞为吸附细胞、激活型肝星状细胞为靶细胞，采用噬菌体展示技术进行差减筛选，并最终得到一种与激活型肝星状细胞结合且具有高度特异性的多肽。本发明专利技术制备方法中库容量大，筛选成功率高，操作简单，成本低。本发明专利技术所得多肽可用于制备肝纤维化诊断试剂或肝纤维化靶向治疗药物中，可以为肝纤维化的早期诊断和靶向治疗提供新的有效手段。

【技术实现步骤摘要】
与激活型肝星状细胞特异性结合的多肽及制备方法和应用
本专利技术涉及一种与激活型肝星状细胞特异性结合的多肽及其制备方法，具体属于生物

技术介绍
肝纤维化(hepaticfibrosis)是由各种致病因子所致肝内结缔组织异常增生，导致肝内弥漫性细胞外基质(extracellularmatrix，ECM)过度沉淀的病理过程。病毒性肝炎、酒精肝、脂肪肝、自身免疫性肝病等多种肝病都可导致肝纤维化发生，是肝纤维化的常见病因。在我国，病毒性肝炎的发病率很高，其他肝病也较为常见，这些疾病的慢性发展通常演化为肝纤维化、肝硬化，甚至导致肝癌，已经成为严重影响我国人民健康的重大疾患之一。目前普遍认为慢性肝损伤在肝纤维化阶段是可逆转的，因此如何有效地控制及逆转肝纤维化，防止其进一步演变具有极其重要的意义。在对肝纤维化发病机制的研究中发现，肝星状细胞(hepaticstellatecells，HSCs)激活在肝纤维化病理过程中扮演着关键性角色。在慢性肝损伤过程中，肝细胞、肝库普弗细胞、血小板、内皮细胞等释放一系列细胞因子使静止型HSCs激活转化为激活型HSCs，即肌成纤维细胞样细胞(myofibroblast-likecells，MFCs)。激活型HSCs分泌大量的胶原蛋白，使Disse间隙的ECM增多；同时上调基质金属蛋白酶抑制剂(matrixmetalloproteinaseinhibitor，MMPI)和组织金属蛋白酶抑制剂(tissueinhibitorofmetalloproteinase，TIMP)的表达，使ECM降解减少，导致ECM不断堆积增加而形成肝纤维化和肝硬化。HSCs的活化是肝纤维化发生发展过程中的中心事件，激活型HSCs是肝纤维化发生发展中的“罪魁祸首”，也是肝纤维化防治的关键靶细胞。因此，筛选出一种与激活型肝星状细胞特异性结合的多肽，显得尤为必要。
技术实现思路
为解决现有技术的不足，本专利技术的目的在于提供一种与激活型肝星状细胞特异性结合的多肽及制备方法和应用，所得多肽可以与激活型肝星状细胞特异性结合，其制备方法操作简单，准确度高；所得多肽可用于制备肝纤维化诊断试剂或肝纤维化靶向治疗药物中。为了实现上述目标，本专利技术采用如下的技术方案：与激活型肝星状细胞特异性结合的多肽，所述多肽的氨基酸序列为Thr-Val-Arg-Thr-Ser-Ala-Asp。一种与激活型肝星状细胞特异性结合的多肽的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：(1)静止型肝星状细胞与激活型肝星状细胞培养；(2)以静止型肝星状细胞为吸附细胞、激活型肝星状细胞为靶细胞，采用噬菌体展示技术进行差减筛选；(3)经DNA测序确定目标多肽。前述与激活型肝星状细胞特异性结合的多肽的制备方法中，步骤(2)以静止型肝星状细胞为吸附细胞、激活型肝星状细胞为靶细胞，采用噬菌体展示技术进行差减筛选，具体为：分别取步骤(1)中培养的生长良好的静止型肝星状细胞以及激活型肝星状细胞，在37℃、体积浓度5％的CO2条件下，置于无血清培养基中培养2h后，备用；分别在所得静止型肝星状细胞以及激活型肝星状细胞培养皿中加入BSA，在37℃、50rpm条件下，恒温培养摇床中封闭；在静止型肝星状细胞中加入噬菌体原始肽库的稀释液，在37℃、50rpm条件下恒温培养摇床中孵育；随后将与静止型肝星状细胞孵育后的上清液加入封闭后的激活型肝星状细胞中，在37℃、50rpm条件下恒温培养摇床中孵育，弃去与激活型肝星状细胞孵育后的上清液，用PBST缓冲液洗涤6次，加入pH＝2.2的甘氨酸-盐酸缓冲液，置于37℃、50rpm条件下恒温培养摇床中洗脱；收集洗脱液，加入pH＝9.1的Tris-HCl缓冲液进行中和；测定洗脱液所含噬菌体滴度；随后取该洗脱液感染宿主菌E.coliER2738进行扩增，扩增后噬菌体通过离心以及PEG/NaCl沉淀的方法进行纯化，再次测定扩增、纯化后噬菌体滴度，完成第一轮筛选；重复以上步骤数次，筛选结束。本申请中采用差减筛选的方法，先去除与静止型肝星状细胞结合的噬菌体，随后去除不与激活型肝星状细胞结合的噬菌体，通过逐步的筛选过程，使得最终所得噬菌体具备仅与激活型肝星状细胞特异性结合的特性，保障了最终筛选结果的高效性、准确性。进一步地，前述与激活型肝星状细胞特异性结合的多肽的制备方法中，步骤(2)以静止型肝星状细胞为吸附细胞、激活型肝星状细胞为靶细胞，采用噬菌体展示技术进行差减筛选，具体为：分别取步骤(1)中培养的生长良好的静止型肝星状细胞以及激活型肝星状细胞，在37℃、体积浓度5％的CO2条件下，置于无血清培养基中培养2h后，备用；分别在所得静止型肝星状细胞以及激活型肝星状细胞培养皿中加入1.5mL质量浓度为1％的BSA，在37℃、50rpm条件下，恒温培养摇床中封闭30min；在静止型肝星状细胞中加入1.5mL滴度为2×1011pfu的噬菌体原始肽库的稀释液，在37℃、50rpm条件下恒温培养摇床中孵育1h；随后将与静止型肝星状细胞孵育后的上清液加入封闭后的激活型肝星状细胞中，在37℃、50rpm条件下恒温培养摇床中孵育1h，弃与激活型肝星状细胞孵育后的上清液，用0.1％～0.3％PBST缓冲液洗涤6次，加入1mL0.2mol/L的pH＝2.2的甘氨酸-盐酸缓冲液，置于37℃、50rpm条件下恒温培养摇床中洗脱10min；收集洗脱液，加入150μL1mol/L的pH＝9.1的Tris-HCl缓冲液进行中和；测定洗脱液中所含噬菌体滴度；随后取0.5mL该洗脱液感染宿主菌E.coliER2738进行扩增，扩增后噬菌体通过离心以及PEG/NaCl沉淀的方法进行纯化，再次测定扩增、纯化后噬菌体滴度，完成第一轮筛选；重复以上步骤数次，筛选结束。进一步地，前述与激活型肝星状细胞特异性结合的多肽的制备方法中，步骤(2)中共完成3～5轮筛选，所用0.1％～0.3％PBST缓冲液是指含Tween-20体积浓度为0.1％～0.3％的PBS缓冲液。优选地，前述与激活型肝星状细胞特异性结合的多肽的制备方法，步骤(2)中共完成4轮筛选；其中，第一轮筛选中所用0.1％PBST缓冲液为含Tween-20体积浓度为0.1％的PBS缓冲液；第二轮筛选中所用PBST缓冲液为0.2％PBST缓冲液，即含Tween-20体积浓度为0.2％的PBS缓冲液；第三轮和第四轮筛选中所用PBST缓冲液为0.3％PBST缓冲液，即含Tween-20体积浓度为0.3％的PBS缓冲液；第四轮筛选时洗脱液进行滴度测定后不再进行扩增纯化。本申请中优选采用在不同的筛选阶段选用不同浓度的缓冲液进行筛选操作，筛选范围由大到小逐渐收缩，提升了筛选得到合适噬菌体的可能性，提高了筛选成功率。前述与激活型肝星状细胞特异性结合的多肽的制备方法中，步骤(3)经DNA测序确定目标多肽，具体为：取最后一轮筛选后的洗脱液进行噬菌体滴度测定时，选取若干个阳性噬菌体克隆，分别进行扩增和纯化，随后进行DNA测序，选取测序结果显示插入序列重复次数最多的噬菌体，其所展示的多肽即为目标多肽。测序结果显示插入序列重复次数越多的噬菌体，其与激活型肝星状细胞结合的特异性就越高、亲和力也越高，该噬菌体展示的多肽即为与激活型肝星状细胞特异性结合且亲和力较高的多肽。前本文档来自技高网...

【技术保护点】
与激活型肝星状细胞特异性结合的多肽，其特征在于：所述多肽的氨基酸序列为Thr‑Val‑Arg‑Thr‑Ser‑Ala‑Asp。

【技术特征摘要】
1.与激活型肝星状细胞特异性结合的多肽，其特征在于：所述多肽的氨基酸序列为Thr-Val-Arg-Thr-Ser-Ala-Asp。2.如权利要求1所述的与激活型肝星状细胞特异性结合的多肽的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：(1)静止型肝星状细胞与激活型肝星状细胞培养；(2)以静止型肝星状细胞为吸附细胞、激活型肝星状细胞为靶细胞，采用噬菌体展示技术进行差减筛选；(3)经DNA测序确定目标多肽。3.根据权利要求2所述的与激活型肝星状细胞特异性结合的多肽的制备方法，其特征在于：所述步骤(2)以静止型肝星状细胞为吸附细胞、激活型肝星状细胞为靶细胞，采用噬菌体展示技术进行差减筛选，具体为：分别取步骤(1)中培养的生长良好的静止型肝星状细胞以及激活型肝星状细胞，在37℃、体积浓度5％的CO2条件下，置于无血清培养基中培养2h后，备用；分别在所得静止型肝星状细胞以及激活型肝星状细胞培养皿中加入BSA，在37℃、50rpm条件下，恒温培养摇床中封闭；在静止型肝星状细胞中加入噬菌体原始肽库的稀释液，在37℃、50rpm条件下恒温培养摇床中孵育；随后将与静止型肝星状细胞孵育后的上清液加入封闭后的激活型肝星状细胞中，在37℃、50rpm条件下恒温培养摇床中孵育，弃与激活型肝星状细胞孵育后的上清液，用PBST缓冲液洗涤6次，加入pH＝2.2的甘氨酸-盐酸缓冲液，置于37℃、50rpm条件下恒温培养摇床中洗脱；收集洗脱液，加入pH＝9.1的Tris-HCl缓冲液进行中和；测定洗脱液所含噬菌体滴度；随后取该洗脱液感染宿主菌E.coliER2738进行扩增，扩增后噬菌体通过离心以及PEG/NaCl沉淀的方法进行纯化，再次测定扩增、纯化后噬菌体滴度，完成第一轮筛选；重复以上步骤数次，筛选结束。4.根据权利要求3所述的与激活型肝星状细胞特异性结合的多肽的制备方法，其特征在于：所述步骤(2)以静止型肝星状细胞为吸附细胞、激活型肝星状细胞为靶细胞，采用噬菌体展示技术进行差减筛选，具体为：分别取步骤(1)中培养的生长良好的静止型肝星状细胞以及激活型肝星状细胞，在37℃、体积浓度5％的CO2条件下，置于无血清培养基中培养2h后，备用；分别在所得静止型肝星状细胞以及激活型肝星状细胞培养皿中加入1.5mL质量浓度为1％的BSA，在37℃、50rpm条件下，恒温培养摇床中封闭30min；在静止型肝星状细胞中加入1.5mL滴度为2×1011pfu的噬菌体原始肽库的稀释液，在37℃、50rpm条件下恒温培养摇床中孵育1h；随后将与静止型肝星状细胞孵育后的上清液加入封闭后的激活型肝星状细胞中，在37℃、50rpm条件下恒温培养摇床中孵育1h，弃与激活型肝星状细胞孵育后的上清液，用0.1％～0.3％PBST缓冲液洗涤6次，加入1mL0.2mol/L的pH＝2.2的甘氨酸...

【专利技术属性】
技术研发人员：张金娟，杨勤，陈腾祥，田甜，郭晓婷，肖俊，韩冰，谢汝佳，罗新华，
申请(专利权)人：贵州医科大学，
类型：发明
国别省市：贵州,52