一种副猪嗜血杆菌特异性血清的制备方法技术

本发明专利技术属于生物技术领域，具体涉及一种副猪嗜血杆菌特异性血清的制备方法。所述制备方法包括：用进口完全弗氏佐剂注射家兔足下诱导腘淋巴结肿大；用1免免疫原对家兔分别进行腘淋巴结注射和皮下注射；再用2免免疫原对家兔进行皮下注射；最后进行超强化免疫，采集兔血，收获血清。本发明专利技术制备方法改变了免疫途径，通过诱导腘淋巴结肿大，更好地激发了外周免疫器官及中枢免疫系统，本发明专利技术制备所得副猪嗜血杆菌血清具有高效价(IHA抗体效价可达到210)、特异性强、成本低等优点。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于生物
，具体涉及一种副猪嗜血杆菌特异性血清的制备方法。
技术介绍
副嗜血杆菌病：又称多发性纤维素性浆膜炎和关节炎，也称H.parasuis。可以引起猪的格氏病(Glasser‘sdisease)。临床上以体温升高、关节肿胀、呼吸困难、多发性浆膜炎、关节炎和高死亡率为特征的传染病，严重危害仔猪和青年猪的健康。目前，副猪嗜血杆菌病已经在全球范围影响着养猪业的发展，给养猪业带来巨大的经济损失。目前已有副猪嗜血杆菌高免血清制备的方法，该方法系免疫实验猪，肌肉注射副猪嗜血杆菌灭活疫苗后采集血清制备而成。该血清主要用于副猪嗜血杆菌诊断、副猪嗜血杆菌阴性动物筛选及疫苗免疫效果监测。但该副猪嗜血杆菌高免血清制备方法存在以下缺点：①成本较高：大型动物成本比小型动物要高；②免疫方法单一：只采用了肌肉注射进行免疫，疫苗吸收缓慢，产生抗体较慢；③佐剂：常规灭活疫苗佐剂，吸收缓慢；④特异性差：因副猪嗜血杆菌为猪源易感菌，如果使用猪作为实验动物，得到的抗体容易与猪源其它菌有交差反应，得到的抗体不利用于猪源的血清学诊断。
技术实现思路
本专利技术针对现有技术中存在的不足，目的在于提供一种副猪嗜血杆菌特异性血清的制备方法。为实现上述专利技术目的，本专利技术所采用的技术方案为：一种副猪嗜血杆菌特异性血清的制备方法，包括如下步骤：(1)免疫原的制备：将副猪嗜血杆菌在培养基上培养后，收获菌液，调节菌含量≥1.0×1010CFU/ml，采用常规方法将菌灭活后，分别用等量进口完全弗氏佐剂乳化得到1免免疫原、用等量的不完全弗氏佐剂乳化得到2免免疫原；(2)诱导腘淋巴结肿大：选择1.5kg～2.0kg家兔，用进口完全弗氏佐剂注射家兔足下，诱导腘淋巴结肿大；(3)第1次免疫：采用步骤(1)所得1免免疫原对步骤(2)处理过的1.5kg～2.0kg家兔进行第一次免疫；(4)第2次免疫：第1次免疫14日后，用步骤(1)所得2免免疫原进行第二次免疫；(5)超强化免疫：在每只家兔耳缘静脉注射副猪嗜血杆菌灭活菌液进行超强化免疫；(6)采集兔血：超强化免疫5日后，采少量的血检验抗体效价，IHA效价达到210以上，对所有的家兔颈动脉放血；(7)收获血清：将收获的兔血放置在37℃恒温箱中2h，再将兔血放置于2～8℃的冰箱中16～24h；然后以3000r/min的转速将兔血离心10min，随后将血清吸出，用0.20～0.22μm的滤膜过滤，无菌分装，即得到副猪嗜血杆菌的特异性血清。上述方案中，步骤(2)所述诱导腘淋巴结肿大，用进口完全弗氏佐剂注射每只家兔的两边足底，每只足底分别注射0.3～0.5mL，待两边的腘淋巴结肿大成黄豆大小时，再进行第一次免疫。上述方案中，步骤(3)所述第一次免疫的免疫方法及剂量为：分别对两边的腘淋巴结进行腘淋巴结注射，同时进行皮下注射；每边腘淋巴结的注射量为0.3～0.5mL，皮下注射的注射量为3mL～4mL。上述方案中，步骤(2)所述第二次免疫的免疫方法及剂量为：每只家兔3～4mL，进行皮下注射。上述方案中，所述皮下注射为皮下多点注射。上述方案中，步骤(3)所述超强化免疫中使用的副猪嗜血杆菌灭活菌液为菌含量为1×109～1.0×1010CFU/mL的副猪嗜血杆菌经灭活后所得菌液。上述方案中，步骤(3)所述超强化免疫中副猪嗜血杆菌灭活菌液的注射剂量为0.3～0.5mL。上述方案中，对家兔进行颈动脉放血的当天停止喂食。本专利技术制备所得副猪嗜血杆菌特异性血清按以下方法进行血清检验：(1)性状检验：乳白色疏松团块，易与瓶壁脱离，加稀释液迅速溶解；(2)无菌检验：按现行《中国兽药典》方法进行检验，应无菌生长；(3)IHA抗体效价测定：≥210；所述血清加冻干保护剂经冷冻干燥冻干之后于-70℃保存5年，IHA抗体效价测定：应≥29；(4)特异性检验：用猪传染性胸膜肺炎放线杆菌、猪链球菌、猪巴氏杆菌、猪波氏杆菌的灭活抗原分别与所述副猪嗜血杆菌血清做玻片凝集，应无凝集反应。(5)剩余水份测定，按现行《中国兽药典》方法进行检验，应符合规定。(6)真空度检验，按现行《中国兽药典》方法进行检验，应符合规定。本专利技术所述制备方法中，采用免疫家兔替代了传统制备方法对猪的免疫，实验动物替换降低了实验动物成本，大约可节约成本约1340元，具体计算方式如下：(1)节约饲料成本140元：(实验猪(180元/月/头×3头＝540)-家兔(30元/月/只×10只＝300)＝140元)；(2)动物成本1200元：(实验猪(700元/头×3头＝2100)-家兔(90元/只×10只＝900)＝1200元)。本专利技术的有益效果：与现有技术相比，本专利技术改变了免疫途径，首先采用腘淋巴结注射及皮下多点注射成功诱导腘淋巴结肿大，更好地激发了外周免疫器官及中枢免疫系统，然后对腘淋巴结和皮下注射免疫原进行第一次免疫，进一步通过第二次免疫和超强化免疫后获得免疫血清，本专利技术所述方法制备所得副猪嗜血杆菌血清具有高效价(IHA抗体效价可达到210)、特异性强、成本低等优点。具体实施方式为了更好地理解本专利技术，下面结合实施例进一步阐明本专利技术的内容，但本专利技术的内容不仅仅局限于下面的实施例。以下实施例中，副猪嗜血杆菌特异性血清按以下方法进行血清检验：(1)性状检验：乳白色疏松团块，易与瓶壁脱离，加稀释液迅速溶解；(2)无菌检验：按现行《中国兽药典》方法进行检验，应无菌生长；(3)IHA抗体效价测定：≥210；所述血清加冻干保护剂经冷冻干燥冻干之后于-70℃保存5年，IHA抗体效价测定：应≥29；(4)特异性检验：用猪传染性胸膜肺炎放线杆菌、猪链球菌、猪巴氏杆菌、猪波氏杆菌的灭活抗原分别与所述副猪嗜血杆菌血清做玻片凝集，应无凝集反应。(5)剩余水份测定，按现行《中国兽药典》方法进行检验，应符合规定。(6)真空度检验，按现行《中国兽药典》方法进行检验，应符合规定。以下实施例中，副猪嗜血杆菌间接血凝抗体检测的方法为：(1)用微量移液器吸取1％待检血清稀释液30μL于96孔“V”型间接血凝板的第1孔，后依次作2倍系列稀释至第12孔；(2)每孔加30μL致敏的红细胞悬液，第12孔为空白对照，仅加稀释液，另设下列对照：致敏红细胞加阳性血清、致敏红细胞加健康兔血清、致敏红细胞加稀释液及阴性血清；(3)在微型振荡器上轻振l分钟，使其充分混合，37℃孵育2小时后观察结果；(4)用“－”、“++”、“+++”、“++++”表示红细胞的凝集强度，以出现“++”的清最高稀释倍数为该血清的血凝效价。“++++”表示凝集的红细胞呈薄膜状均匀铺满孔底，强凝集时，凝集皱缩成团。“+++”表示凝集的红细胞铺满孔底，但中央有少量红细胞沉降成小圆点。“++”表示红细胞沉于孔底中央，周围仍然有散在的凝集红细胞。“－”表示红细胞全部沉在孔底中央，周围无散在的红细胞。判定标准：被检血清间接血凝试验效价大于22判为阳性，小于等于22判为阴性。实施例1副猪嗜血杆菌特异性血清的制备一种副猪嗜血杆菌特异性血清，通过如下方法制备得到：(1)免疫原的制备：将副猪嗜血杆菌在培养基上培养后，收获菌液，调节菌含量≥1.0×1010CFU/ml，采用常规方法将菌灭活后，分别用等量进口完全弗氏佐剂乳化得到1免免疫原、用等量的不完全弗氏佐剂乳化得到2本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种副猪嗜血杆菌特异性血清的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：（1）免疫原的制备：将副猪嗜血杆菌在培养基上培养后，收获菌液，调节菌含量≥1.0×1010CFU/ml，采用常规方法将菌灭活后，分别用等量的进口完全弗氏佐剂乳化得到1免免疫原、用等量的不完全弗氏佐剂乳化得到2免免疫原；（2）诱导腘淋巴结肿大：选择1.5kg~2.0kg家兔，用进口完全弗氏佐剂注射家兔足下，诱导腘淋巴结肿大；（3）第1次免疫：采用步骤（1）所得1免免疫原对步骤（2）处理过的1.5kg~2.0kg家兔进行第一次免疫；（4）第2次免疫：第1次免疫14日后，用步骤（1）所得2免免疫原进行第二次免疫；（5）超强化免疫：在每只家兔耳缘静脉注射副猪嗜血杆菌灭活菌液进行超强化免疫；（6）采集兔血：超强化免疫5日后，采少量的血检验抗体效价，IHA效价达到210以上，对所有的家兔颈动脉放血；（7）收获血清：将收获的兔血放置在37℃恒温箱中2h，再将兔血放置于2~8℃的冰箱中16~24h；然后以3000r/min的转速将兔血离心10min，随后将血清吸出，用0.20~0.22μm的滤膜过滤，无菌分装，即得到副猪嗜血杆菌的特异性血清。...

【技术特征摘要】
1.一种副猪嗜血杆菌特异性血清的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：（1）免疫原的制备：将副猪嗜血杆菌在培养基上培养后，收获菌液，调节菌含量≥1.0×1010CFU/ml，采用常规方法将菌灭活后，分别用等量的进口完全弗氏佐剂乳化得到1免免疫原、用等量的不完全弗氏佐剂乳化得到2免免疫原；（2）诱导腘淋巴结肿大：选择1.5kg~2.0kg家兔，用进口完全弗氏佐剂注射家兔足下，诱导腘淋巴结肿大；（3）第1次免疫：采用步骤（1）所得1免免疫原对步骤（2）处理过的1.5kg~2.0kg家兔进行第一次免疫；（4）第2次免疫：第1次免疫14日后，用步骤（1）所得2免免疫原进行第二次免疫；（5）超强化免疫：在每只家兔耳缘静脉注射副猪嗜血杆菌灭活菌液进行超强化免疫；（6）采集兔血：超强化免疫5日后，采少量的血检验抗体效价，IHA效价达到210以上，对所有的家兔颈动脉放血；（7）收获血清：将收获的兔血放置在37℃恒温箱中2h，再将兔血放置于2~8℃的冰箱中16~24h；然后以3000r/min的转速将兔血离心10min，随后将血清吸出，用0.20~0.22μm的滤膜过滤，无菌分装，即得到副猪嗜血杆菌的特异性血清。2....

【专利技术属性】
技术研发人员：贺跃飞，徐高原，尹争艳，陈斌，周明光，张勤学，王进，
申请(专利权)人：武汉科前生物股份有限公司，
类型：发明
国别省市：湖北;42