b型流感嗜血杆菌结合疫苗的制备方法技术

本发明专利技术提供一种佐剂吸附b型流感嗜血杆菌结合疫苗的制备方法及冻干b型流感嗜血杆菌结合疫苗的制备方法，产品效果良好。本发明专利技术的制备方法，包括以下步骤：1)将b型流感嗜血杆菌多糖降解；2)对降解后的b型流感嗜血杆菌多糖进行活化；3)将活化的b型流感嗜血杆菌多糖和破伤风类毒素用化学方法进行结合；4)对结合后的b型流感嗜血杆菌多糖-破伤风类毒素结合物进行纯化。

【技术实现步骤摘要】
【专利摘要】本专利技术提供一种佐剂吸附及冻干，产品效果良好。本专利技术的制备方法，包括以下步骤：1)将b型流感嗜血杆菌多糖降解；2)对降解后的b型流感嗜血杆菌多糖进行活化；3)将活化的b型流感嗜血杆菌多糖和破伤风类毒素用化学方法进行结合；4)对结合后的b型流感嗜血杆菌多糖-破伤风类毒素结合物进行纯化。【专利说明】
： 本专利技术涉及疫苗制备方法
，提供了一种制备b型流感嗜血杆菌多糖-蛋 白结合物的结合技术，基于此结合技术，制备出了具有较高免疫原性的b型流感嗜血杆菌 结合疫苗。
技术介绍
： b型流感嗜血杆菌（Haemophilus Influenzae Type b，简称Hib)，是全世界儿童发 病和死亡的主要原因之一，b型流感嗜血杆菌感染性疾病主要发生在5岁以下儿童，一旦被 Hib感染，婴幼儿很有可能受到肺炎和脑膜炎等可怕疾病的侵袭，还可能并发严重的神经系 统后遗症，包括耳聋、语言障碍或延迟、视力障碍、智力低下和运动功能异常等。目前研究发 现，人类是Hib的唯一宿主，病菌的传播主要通过空气飞沫及与病菌携带者亲密接触。 Hib的荚膜多糖主要成分是多聚核糖基核糖醇磷酸盐（Polyribose ribitol phosphate，PRP)，是Hib的主要毒力因子之一，由此制备成的多糖疫苗具有一定的免疫预 防效果，但由于多糖属于T细胞非依赖性抗原，因此抗体的产生与年龄具有相关性。成人接 种后可产生免疫应答且抗体长期存在；2岁以上儿童接种疫苗后可产生抗体，但维持时间 较短，并且重复接种也无加强反应；在免疫系统机能发育尚不完善的2岁以下婴幼儿中，不 能有效刺激机体产生抗体。 Hib结合疫苗是将PRP以共价键的方式结合到具有免疫原性的蛋白载体上制备 的。与多糖疫苗相比，Hib结合疫苗不仅能刺激婴幼儿机体产生强的免疫反应，而且再次接 种也能加强反应，从而提高疫苗的保护性能。 多糖和蛋白质主要是通过化学方法进行偶联的，目前普遍运用的多糖蛋白结合物 制备方法是：用CNBr活化Hib多糖并与己二酰肼连接制备衍生物，然后在碳二亚胺的作用 下多糖衍生物通过己二酰肼的桥连作用与载体蛋白结合，最后经凝胶过滤层析纯化获得高 分子多糖蛋白结合物。然而这种多糖蛋白结合物制备技术存在着以下不足：（1)工艺复杂， 反应周期长；（2)EDAC在介导多糖ADH衍生物与载体蛋白结合的同时，容易引起载体蛋白的 自身交联，形成载体蛋白的聚合物，从而降低多糖-蛋白的结合效率；（3) Hib荚膜多糖的分 子大小分布不均，每个批次的分子大小分布存在较大差异，导致每批多糖蛋白结合疫苗的 理化指标各异，影响生产工艺的稳定性、成品疫苗的批间稳定性和成品疫苗质量的一致性。 本专利技术提供了一种新的多糖蛋白结合方法，采用化学方法将Hib多糖降解成分子 量均一的小分子多糖，减小多糖分子大小批间差异，生产工艺的稳定性和产品质量一致性 显著提高。用CDAP活化多糖后直接与载体蛋白结合，不添加 EDAC可避免载体蛋白的自身 交联，缩短了生产周期，提高了结合物收率。 本专利技术还提供一种佐剂吸附及冻干b型流 感嗜血杆菌结合疫苗的制备方法，产品效果良好。
技术实现思路
： 本专利技术提供了一种新的b型流感嗜血杆菌多糖-破伤风类毒素结合物制备方法。 本专利技术进一步提供用本专利技术的方法制备的b型流感嗜血杆菌多糖-破伤风类毒素 结合疫苗及其制剂。 本专利技术所述的b型流感嗜血杆菌多糖-破伤风类毒素结合物的制备方法，包括以 下步骤： 1)将b型流感嗜血杆菌多糖降解； 2)对降解后的b型流感嗜血杆菌多糖进行活化； 3)将活化的b型流感嗜血杆菌多糖和破伤风类毒素用化学方法进行结合； 4)对结合后的b型流感嗜血杆菌多糖-破伤风类毒素结合物进行纯化。 其中，步骤1)所述将b型流感嗜血杆菌多糖降解，方法为： b型流感嗜血杆菌多糖用0· 02mol/L?0· 04mol/L乙酸钠溶液溶解（4?5mg/ ml)，加入终浓度为0. 5%?3%的过氧化氢，于50?60°C反应20?40分钟。用注射用水 或2mol/L氯化钠溶液作为缓冲液，超滤或透析去除小分子物质，得到降解后的b型流感嗜 血杆菌多糖。 其中，步骤2)所述对降解后的b型流感嗜血杆菌多糖进行活化，方法为 取降解后的多糖溶液，浓度控制在4-20mg/ml，加入CDAP，多糖投入量与CDAP比例 为1:0. 25?1:2,维持反应20?300秒。加入过量的三乙胺溶液，反应溶液pH值控制在 8. 5?10. 5之间，冰浴或室温反应5?8分钟后，调pH值至8. 3?8. 9之间。 其中，步骤3)所述将活化的b型流感嗜血杆菌多糖和破伤风类毒素用化学方法进 行结合， 方法为： 根据多糖投入量，按1:0. 5?1:3的比例加入纯化破伤风类毒素原液（以蛋白含 量计算），混匀后维持pH在8. 3?8. 9之间反应1?2小时。反应结束后调pH值至4. 8? 5. 2之间，加入过量的甘氨酸溶液，30?60分钟后终止反应，用0. 02?0. 2mol/L氯化钠溶 液作为缓冲液，超滤或透析去除小分子物质。 其中，步骤4)所述对结合后的b型流感嗜血杆菌多糖-破伤风类毒素结合物进行 纯化，方法为： 用0· 02?0· 2mol/L氯化钠溶液作为流动相，多糖-蛋白结合物经Sephacryl S-400HR层析纯化，上样量不能超过柱体积的10%，收集K d < 0. 4的洗脱液段，适当稀释后 经0. 2 μ m无菌滤器除菌过滤后即得b型流感嗜血杆菌多糖-破伤风类毒素结合物。 本专利技术所述的b型流感嗜血杆菌多糖-破伤风类毒素结合物的制备方法，优选的 步骤1)所述多糖降解，其中所述乙酸钠溶液浓度为0· Olmol/L?0· 10m〇l/L，最佳 为0. 02mol/L?0. 04mol/L ;所述多糖溶解浓度为1?10mg/ml，最佳为4?5mg/ml ;所述 加入的过氧化氢浓度为0. 1?5%，最佳为0. 5?3%, 步骤2)所述多糖活化，其中所述多糖投入量与CDAP比例为1:0. 25?1:2 (g/g)， 维持反应20-300秒；诉述加入三乙胺浓度为0. 2mol/L，反应时间5?8分钟，维持pH值 8. 5?10. 5之间，后将溶液的pH值调至8. 3?8. 9之间， 步骤3)所述多糖蛋白结合，其中所述多糖与蛋白质加入的质量混合比例为 1:0. 5?1:3,更佳为1:0. 8?1:1. 5,最佳为I : 1 ;所述维持pH值在8. 0?9. 0之间，更佳为 8. 3?8. 9范围；所述反应时间为0. 5?4小时，更佳为1?2小时；所述调整pH值4. 5? 6. 0之间，更佳为4. 8?5. 2之间；所述过量甘氨酸溶液为Ig多糖加入50?120g的Imol/ L甘氨酸溶液；所述氯化钠溶液浓度为0. 02?0. 2mol/L， 步骤4)所述多糖蛋白结合物纯化，其中所述氯化钠溶液浓度为0. 02?0. 2mol/L ; 所述层析介质为Sephacryl S-400HR凝胶；所述收集洗脱液为Kd < 0. 4的洗脱液段。 本专利技术进一步包括，将本文档来自技高网...

【技术保护点】
b型流感嗜血杆菌多糖‑破伤风类毒素结合物的制备方法，包括以下步骤：1)将b型流感嗜血杆菌多糖降解；2)对降解后的b型流感嗜血杆菌多糖进行活化；3)将活化的b型流感嗜血杆菌多糖和破伤风类毒素用化学方法进行结合；4)对结合后的b型流感嗜血杆菌多糖‑破伤风类毒素结合物进行纯化。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：苏晓叶，石献华，康鸿宇，孟文茜，潘勇，刘刚，黄颖，杜琳，
申请(专利权)人：北京智飞绿竹生物制药有限公司，
类型：发明
国别省市：北京;11