【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物医药化学领域，具体涉及一种优化多糖蛋白结合物的制备方法。
技术介绍
1、多糖蛋白结合疫苗能有效预防和控制脑膜炎球菌、肺炎球菌、b型流行性感冒嗜血杆菌等侵袭性细菌引起的婴幼儿和高危人群感染。目前,多糖蛋白结合疫苗的研制范围日趋广泛,多糖-蛋白结合疫苗是用化学方法将多糖抗原与载体蛋白共价结合,从而实现多糖抗原类型的转变，随着合成化学应用的日趋成熟,多种结合方法已被用于多糖-蛋白的结合。
2、肺炎球菌多糖结合疫苗是一种更新的肺炎球菌疫苗，与23价多糖疫苗相比，它具有更高的免疫原性和更广泛的覆盖范围。这种疫苗可以预防更多种类的肺炎球菌感染，包括13种以上的血清型。
3、肺炎球菌多糖结合疫苗制备过程中于肺炎链球菌荚膜多糖的分子量较大，导致多糖溶液的粘度也大，造成多糖活化、结合物制备和纯化等步骤难以操作。使用大分子多糖作为原料多糖将导致结合物过度交联、结合物的分子量过大，从而对产品的质量造成风险，可能使免疫效果变差。为改变荚膜多糖的分子量大的这种情况，在进行活化、结合工艺之前，对肺炎球菌荚膜多糖进行降解处理。多糖活化往往包括氧化、衍生等过程，这些化学反应都会对多糖的分子结构进行改变。而多糖蛋白结合过程中，随着反应过程多糖和蛋白不断结合分子量呈现逐渐变大的趋势，粘度也随之变化。
4、目前，肺炎球菌多糖结合疫苗制备过程以检测多糖含量为主要控制手段，方法为《中国药典》现行版(三部)糖含量测定法(蒽酮硫酸法)；纯化方法以切向流超滤和分子筛层析分离为主。批间一致性是多糖结合疫苗的关键点和难点，应控
技术实现思路
1、本专利技术的目的是有效控制肺炎球菌多糖蛋白结合物制备的过程，提供一种简便高效可控的多糖蛋白结合物的制备方法。
2、为了实现本专利技术目的，本专利技术提供了一种肺炎链球菌荚膜多糖蛋白结合物的制备方法，包括：监测肺炎链球菌荚膜多糖降解、活化和结合反应过程粘度值，确定反应过程加入试剂的量；采用二次两级切向流分离纯化和浓缩过程产物和最终结合物。
3、本专利技术的方法适用于所有肺炎链球菌血清型。
4、本专利技术中，制备结合物的肺炎球菌荚膜多糖可以是纯化的原始多糖，也可以是经过物理和(或)化学手段降解的多糖片段，物理降解手段包括超声、微波、减压等，化学降解手段包括酸水解、碱水解、氧化水解等。各血清型的结合物的制备，可以采用以下方法：
5、1.直接结合法：
6、利用多糖结构上固有的反应基团直接或通过间隔剂与载体蛋白质偶联。如利用多糖结构中的羧基，通过碳二亚胺(edac)介导，与己二酰二肼(adh)结合，再与载体蛋白质上的羧基反应，形成多糖蛋白结合物。
7、2.氰基活化法：通过氰根活化多糖结构上的邻羟基，再与间隔剂己二酰二肼相连，制备出衍生多糖。衍生多糖和载体蛋白质在碳二亚胺介导下，由碳二亚胺与载体蛋白质上的羧基形成o-酰基异脲中间体，再与衍生多糖上的胺基反应形成多糖蛋白结合物。
8、这种氰基活化方式采用的氰化物试剂通常为溴化氰、1-氰基-4-二甲氨基-吡啶四氟硼酸(cdap)等。采用的间隔剂包括丁二酸二酰肼、己二酰二肼等二肼类化合物，还包括二氨基乙烷、二氨基丙烷、二氨基丁烷、二氨基己烷等二氨基烷类化合物，也包括己二酸二琥珀酰亚胺酯等酯类化合物，还包括含反应官能团不一致的间隔剂，如氨基硫醇。也有不采用间隔剂，以cdap活化多糖后，直接与载体蛋白质的氨基反应制备多糖蛋白结合物。
9、3.胺还原法：
10、多糖经氧化或水解后，可在末端生成醛基，醛基可与氨基反应形成希夫碱结构，再经还原剂还原，形成稳定的c-n结构，形成多糖蛋白结合物。
11、多糖氧化多采用高碘酸钠法，高碘酸是一种氧化剂。多糖含有丰富的二醇基(choh-choh)，被高碘酸氧化后，断裂形成二个末端醛基。高碘酸的特点是不再进一步氧化已生成的醛基。
12、4.其它结合方法：
13、包括肟化学反应、重氮化反应、二硫键连接反应等。n-琥珀酰亚胺-3-二硫代吡啶丙酸(spdp)是常用的二硫键连接反应试剂，先将spdp连接到含氨基的组份上，与含巯基的组分发生巯基交换反应，形成以二硫键连接的多糖蛋白结合物。
14、本专利技术对以上这些反应步骤，都可用监测粘度的方法控制反应过程，以达到较好的反应效果，然后用两级切向流超滤浓缩透析，分离出每个步骤所需要的分子大小的产物。
15、本专利技术所述的多糖蛋白结合物的制备方法，包括以下步骤：
16、步骤一，多糖降解
17、将肺炎链球菌荚膜多糖，在活化、衍生前采用超声波降解、高温水解、酸水解或其他已知的工艺将多糖分子降解。
18、步骤二，降解物超滤
19、用两级切向流超滤浓缩透析，收集第一级超滤系统的透过液，同时透过液经第二级超滤系统超滤浓缩和透析，收集截留液。
20、其中，所述荚膜多糖为水解后的荚膜多糖，血清型包括但不限于1、2、3、4、5、6a、6b、7f、8、9n、9v、10a、11a、12f、14、15b、17f、18c、22f、23f或33f型。
21、步骤三，多糖活化衍生
22、检测肺炎链球菌荚膜多糖降解物粘度，并在活化过程添加其他化学试剂以及缓冲液稀释至合适粘度，监测反应过程粘度变化；
23、其中，其他化学试剂选自：己二酰二肼、氰基硼氢化钠。
24、其中，缓冲液选自：0.85％氯化钠溶液。
25、其中，1、2、12f型使用缓冲液稀释至4.0-5.0mpa·s；3型使用缓冲液稀释至6.0-7.0mpa·s；5型使用缓冲液稀释至4.5-5.5mpa·s；4、6a、6b、7f、8、9n、9v、10a、11a、14、15b、17f、18c、22f、23f或33f型型使用缓冲液稀释至1.8-2.2mpa·s。
26、步骤四，衍生物超滤
27、使用缓冲液对多糖活化溶液进行超滤，收集超滤浓缩液即为肺炎链球菌荚膜多糖活化物。
28、步骤五，多糖蛋白结合
29、使用缓冲液稀释多糖活化物至合适粘度，室温条件下按比例加入反应试剂和载体蛋白，用缓冲液调节粘度，搅拌反应2-4h，监测反应过程粘度变化。
30、其中，所述多糖蛋白质量比例为1:1-1:2之间。
31、其中，反应试剂选自：碳二亚胺、cdap、乙腈、三乙胺。
32、其中，缓冲液选自：0.85％氯化钠溶液、2mol/l氯化钠溶液溶解。
33、其中，1、4型使用缓冲液稀释至1.1-1.2mpa·s；2、12f型使用缓冲液稀释至1.5-1.7mpa·s；3型使用缓冲液稀释至1.3-1.5mpa·s；5、7f型使用缓冲液稀释至1.8-2.2mpa·s；6a、6b、8、9n、本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种多糖-蛋白结合物的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：监测肺炎链球菌荚膜多糖降解、活化和结合反应过程粘度值，确定活化和结合反应加入试剂的量，并在反应中进行粘度控制；采用二次两级切向流分离纯化和浓缩过程产物和最终结合物。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，包括以下步骤：
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，包括以下步骤：
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：该方法适用于所有肺炎链球菌血清型。
9.两级切向流超滤系统，其特征在于，
【技术特征摘要】
1.一种多糖-蛋白结合物的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：监测肺炎链球菌荚膜多糖降解、活化和结合反应过程粘度值，确定活化和结合反应加入试剂的量，并在反应中进行粘度控制；采用二次两级切向流分离纯化和浓缩过程产物和最终结合物。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，
4.根据权利要...
【专利技术属性】
技术研发人员：马可，苏晓叶，高庚，田雨，张霁，刘刚，杜琳，
申请(专利权)人：北京智飞绿竹生物制药有限公司，
类型：发明
国别省市：
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