【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物制品制备，具体地说，涉及了一种肺炎球菌多糖蛋白结合物组合疫苗及制备方法，本专利技术制备的26价肺炎球菌结合疫苗用于肺炎球菌感染的免疫预防和诊断治疗。
技术介绍
1、肺炎球菌性疾病是全球严重的公共卫生问题之一，其病原体肺炎球菌定植于鼻咽部，通常不引起临床症状。当定植的环境发生变化，如机体抵抗力下降、麻疹或流行性感冒(流感)等呼吸道病毒感染、营养不良或年老体弱等情况下，肺炎球菌将透过黏膜防御体系发生侵袭性感染。大约75％的侵袭性肺炎球菌性疾病例(ipd)和83％的肺炎球菌脑膜炎发生在2岁以下儿童(who立场文件2019版)。2岁以下儿童是最容易感染肺炎球菌病的人口，其病死率特别高。
2、肺炎链球菌分泌荚膜包围在细胞壁外面，荚膜是肺炎链球菌主要毒力因子。根据荚膜的不同将肺炎球菌分为近100个血清型，优势血清型的分布在各个时期、各个地区都会有差异。
3、肺炎球菌疫苗是预防肺炎球菌感染的最有效手段，目前已上市的疫苗为肺炎球菌多糖疫苗(pneumococcal polysaccharide vaccine，ppv)和肺炎球菌结合疫苗(pneumococcal conjugate vaccine，pcv)。上世纪80年代时，惠氏公司(2009年被辉瑞收购)生产的23价肺炎球菌多糖疫苗(ppv23)对优势血清型的免疫覆盖率可以在全球各个洲都达到90％左右。但肺炎球菌荚膜多糖是胸腺非依赖性抗原(ti)抗原，不能在<2岁儿童中诱导有效的免疫应答，而该年龄段人群是肺炎球菌感染的高危人群。肺炎球菌多糖蛋白
4、目前已上市的肺炎球菌多糖蛋白结合疫苗是通过化学方法将多糖抗原与载体蛋白共价结合，主要方法有两种：胺还原法和氰基活化法，(1)还原胺法。多糖经过高碘酸钠氧化，形成的醛基或酮基与载体蛋白的活性氨基反应，形成c＝n双键，经被还原剂还原成c-n单键，形成稳定的共价连接。(2)氰基活化法。通过溴化氰(cnbr)或1-氰-4-二甲基氨基吡啶四氟硼酸盐(cdap)在多糖上引入氰基，再与蛋白primary-nh2形成共价键。随着结合技术的发展，以这两种结合方法为基础，发展出了一些新的结合手段例如在多糖和蛋白间引入分子臂己二酸二酰肼(adh)，促进多糖和蛋白的结合，或者引入新的连接基团，促进结合反应的发生。
5、但文献报道，在进行多糖蛋白结合反应之前，对多糖的分子大小进行一定程度的降解。常见的降解方法有物理降解、化学降解和酶降解法。物理降解一般包括微波法、辐射法、超声降解法和高压均质仪剪切法，化学降解包括酸水解、碱水解和过氧化氢降解，酶降解法利用专一性或非专一性酶降解多糖。
6、cn108079286a“一种13价肺炎球菌多糖-蛋白结合物组合物及其制备方法和应用”公开了对于分子大小在sepharose cl-4b柱上检测kd值＜0.20的肺炎球菌荚膜多糖，在活化、衍生前采用超声波降解或70-85℃高温水解工艺将多糖分子大小降低到在sepharosecl-4b柱上检测kd值为0.20-0.50之间。
7、cn109862908b“多价肺炎球菌多糖-蛋白质缀合物组合物”公开了氢氧化钠、盐酸、冰醋酸在高温条件下进行水解的方法。
8、cn107810010a“多价肺炎球菌结合疫苗”公开了采用高压均化器降低多糖的分子尺寸。
9、cn103830723a“一种肺炎链球菌荚膜多糖蛋白结合疫苗的制备方法”公开了多糖在冰水浴中，用功率为80-100w，频率为20-40khz的超声波处理溶液。
10、多糖抗原性是免疫反应性和免疫原性的一个重要指标。多糖相对分子质量越大，抗原性越强，相对分子质量的降低可能伴随着抗原性的损失。事实证明，每种多糖降解方法在降低多糖分子大小的同时，都会破坏多糖的特异基团和抗原表位，而且导致降解多糖的质量属性批间差异大。
技术实现思路
1、本专利技术克服了上述多糖抗原性损失的问题，本专利技术采用经菌种发酵、多糖纯化收获的精制多糖，在多糖蛋白结合工艺中精制多糖不经过任何降解处理，直接进行多糖活化、结合反应。这种使用天然纯化的肺炎球菌多糖有效的保护了多糖的抗原性。本专利技术进行连续三批结合物原液和疫苗的生产，多糖收率和各项检定指标稳定，证实本专利技术工艺稳定。
2、本专利技术的目的在于提供一种26价肺炎球菌结合物组合疫苗。
3、本专利技术26价肺炎球菌结合物组合疫苗基于肺炎球菌的荚膜多糖，涵盖了导致肺炎球菌病的最常见血清型。本专利技术在原有23价肺炎球菌多糖疫苗(血清型有1、4、5、6b、7f、8、9n、9v、10a、11a、12f、14、15b、17f、18c、19a、19f、20、22f、23f和33f共23个)的基础上，增加了6a、24f和35b三个血清型，其中6a型是13价肺炎结合疫苗pcv13中的血清型，24f和35b这两个血清型是非疫苗血清型引起的侵入性肺炎球菌病增加趋势较为显著的两个血清型。据文献报道，近年来，血清型24f受到广泛关注，在耐药性侵入性肺炎球菌病病例中尤为常见。德国、英国、西班牙、丹麦、日本等多个国家均报道24f血清型导致的侵入性肺炎球菌病病例数在逐年增加。35b血清型导致的侵入性肺炎球菌病近年来明显增加。23个原有血清型的免疫覆盖率可以在全球各个洲都达到90％左右，本专利技术再加上3个新增血清型，扩大了免疫保护范围，覆盖率远超90％。
4、本专利技术技术方案如下：26价肺炎球菌结合物组合疫苗，包括26种肺炎球菌血清型，结合物由相应血清型的肺炎球菌荚膜多糖与载体蛋白破伤风类毒素通过化学共价结合方法制备的多糖蛋白结合物，26种多糖蛋白结合物原液再与铝佐剂按适当比例吸附后获得肺炎球菌结合疫苗。
5、进一步地，本专利技术26价肺炎球菌结合物组合疫苗包括1、2、3、4、5、6a、6b、7f、8、9n、9v、10a、11a、12f、14、15b、17f、18c、19a、19f、20、22f、23f、24f、33f和35b共26种血清型。
6、在23价肺炎球菌本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种26价肺炎球菌结合物组合疫苗，其特征在于，肺炎球菌荚膜多糖包括：1、2、3、4、5、6A、6B、7F、8、9N、9V、10A、11A、12F、14、15B、17F、
2.根据权利要求1所述的疫苗，其特征在于，
3.根据权利要求1所述的疫苗，其特征在于，
4.根据权利要求1所述的疫苗，其特征在于，疫苗中还含有佐剂，佐剂是铝佐剂，铝佐剂是磷酸铝佐剂。
5.根据权利要求1所述的疫苗，其特征在于，肺炎球菌多糖大部分型别重均分子量Mw在300～800kDa，2型和7F型Mw在900～1200kDa，18C、19A和19F型Mw在100～400kDa。
6.根据权利要求1所述的疫苗，其特征在于，1、4、5、6A、6B、7F、8、9N、
7.根据权利要求1所述的疫苗，其特征在于，4型多糖蛋白结合物原液游离多糖不高于45％，其他25个血清型多糖蛋白结合物原液游离多糖不高于30％，游离蛋白均不高于5％。
8.根据权利要求1所述的疫苗，其特征在于，单位剂量的组合疫苗中，各型肺炎多糖的含量为2.2μg±30％，
9.权利要求1所述的疫苗的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
10.根据权利要求9所述的疫苗的制备方法，其特征在于
...【技术特征摘要】
1.一种26价肺炎球菌结合物组合疫苗，其特征在于，肺炎球菌荚膜多糖包括：1、2、3、4、5、6a、6b、7f、8、9n、9v、10a、11a、12f、14、15b、17f、
2.根据权利要求1所述的疫苗，其特征在于，
3.根据权利要求1所述的疫苗，其特征在于，
4.根据权利要求1所述的疫苗，其特征在于，疫苗中还含有佐剂，佐剂是铝佐剂，铝佐剂是磷酸铝佐剂。
5.根据权利要求1所述的疫苗，其特征在于，肺炎球菌多糖大部分型别重均分子量mw在300～800kda，2型和7f型mw在900～1200kda，18c、19a和19f型mw在1...
【专利技术属性】
技术研发人员：宗向坤，赵林飞，胡小华，姜真，胡国伟，曾力平，马义静，应亚男，李爽，朱卫华，杜琳，
申请(专利权)人：北京智飞绿竹生物制药有限公司，
类型：发明
国别省市：
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