抗人肺炎链球菌fam2家族PspA蛋白抗体及应用该抗体的免疫层析试剂盒制造技术

本发明专利技术涉及抗人肺炎链球菌fam2家族PspA蛋白抗体及应用该抗体检测人肺炎链球菌的免疫层析试剂盒，抗人肺炎链球菌fam2家族PspA蛋白抗体是分别识别人肺炎链球菌fam2家族PspA蛋白34-47位以及274-287位氨基酸所组成的两个线性抗原表位的抗体，人肺炎链球菌fam2家族PspA蛋白在GenBank序列号是WP_054380072.1；人肺炎链球菌fam2家族PspA蛋白34-47位以及274-287位的氨基酸序列分别为SPQVVEKSSLEKKY及KLLDSLDPEGKTQD。本发明专利技术所提供的两种兔抗人肺炎链球菌fam2家族PspA蛋白抗体具有特异性好、纯度高、效价高、制备成本低廉的特点。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于生物医学
，涉及抗人肺炎链球菌fam2家族PspA蛋白抗体及应用该抗体检测人肺炎链球菌的免疫层析试剂盒。
技术介绍
人肺炎链球菌(Streptococcuspneumoniae，Sp)是儿童呼吸道感染的重要病原体。主要经飞沫传播而进入呼吸道，从而寄生于人体的鼻咽部，或侵入人体不易清除的部位引起一系列的疾病，如大叶性肺炎，脑膜炎，支气管炎，中耳炎等。它是全球所有年龄组高发病率和病死率的主要病原菌。其中，在发展中国家，婴幼儿、老年人及免疫缺陷人群中尤为严重。肺炎链球菌于1881年首次由巴斯德(LouisPasteur)及G.M.Sternberg分别在法国及美国从患者痰液中分离出。其为革兰氏染色阳性，菌体似矛头状，成双或成短链状排列的双球菌，有毒株菌体外有化学成分为多糖的荚膜。其荚膜具有抗原性，是肺炎链球菌分型的依据。根据荚膜多糖抗原性的不同将肺炎球菌分为91个血清型。其菌体抗原主要为C多糖，其存在于肺炎链球菌细胞壁中，具有种特异性，为各型菌株所共有。C多糖可被血清中C-反应蛋白沉淀。在钙离子存在时，C多糖可与正常人血清中称为C-反应蛋白(Creactiveprotein,CRP)的β球蛋白结合，发生沉淀。目前针对人肺炎链球菌抗原的检测亦主要是针对此抗原，而该抗原非肺炎链球菌独有，如缓和链球菌亦含有该抗原。并且C多糖的提纯过程困难，造成生产成本较高。在肺炎链球菌表面还有一种与毒力相关的重要抗原，为肺炎链球菌表面蛋白A(PspA)，其存在于所有肺炎链球菌血清型中，是肺炎链球菌的特异性抗原。PspA分为3个家族，其中具有fam1或fam2家族PspA蛋白的人肺炎链球菌占到了临床分离的人肺炎链球菌种类的99％以上。临床病人由于不同的呼吸道病原体(如肺炎支原体、流感嗜血杆菌、流感病毒、呼吸道合胞病毒、腺病毒等)感染引起疾病症状可以十分相似，这导致了流行诊断比较困难，确诊往往依赖于实验室诊断。快速有效的诊断方法应该是在疾病的发病初期就可以得到明确的诊断，便于实施针对性的治疗，阻止病情的发展迁延。尽管肺炎链球菌在全球范围内传播，婴幼儿的感染尤其普遍，但可用于实验室诊断的标准化商品试剂的种类极少。目前，肺炎链球菌的检测主要有以下几种方法：一、常规实验室检测1、细菌分离实验室诊断肺炎链球菌的金标准是分离人肺炎链球菌毒株。采用鼻咽分泌物作为病原体分离的标本，可以用血培养的方法分离病原体。但是该法有严重的缺陷，因为肺炎链球菌是苛养菌，营养要求高，培养所需时间长，阳性率低，更重要的是，若采样前患者使用过抗菌药物，会造成培养结果的假阳性。这样在临床方面对病人的治疗就有一定的局限性。2、血清学检测即采用酶联免疫法、放免法、微量免疫荧光法等，检测被检者血清中肺炎链球菌抗体水平，可间接提示肺炎链球菌感染的存在。然而，血清学试验只能提供一种回顾性的诊断，它需要同时检测患者急性期和恢复期的双份血清，如果恢复期中抗人肺炎链球菌抗体效价比急性期高4倍或4倍以上才有诊断意义。另外，抗体出现的时机不易掌握，且因为菌体血清型种类过多，导致其诱生的抗荚膜多糖抗体种类过多，对抗体的检测造成了很大的困难，故现有血清学方法的检测质量受到一定限制。二、快速诊断直接检查人肺炎链球菌蛋白抗原和菌体核酸可达到快速诊断的目的，目前主要有免疫荧光法、免疫酶法和PCR法等。免疫荧光法和免疫酶法均不能进行一步检测，均存在操作步骤复杂，需要专业人员操作，检测时间长(2h以上)，成本较高等缺点。PCR方法快速、灵敏、特异，是目前研究肺炎链球菌感染的重要手段，但由于PCR对实验设备以及操作要求较高，且易出现假阳性，在我国还不能作为常用的临床诊断方法。目前，检测人肺炎链球菌抗原的方法主要为胶体金法检测其C多糖抗原，但是该法敏感度较低，对待检样品材料质量要求较高，同时还存在与其他链球菌如缓和链球菌存在交叉反应等缺陷。PspA蛋白则是一个极具特异性的检测标的。目前，关于抗人肺炎链球菌PspA蛋白抗体报道得最多的为相应的多克隆抗体。多克隆抗体主要由基因工程表达的PspA蛋白免疫家兔等动物制备而成。其制备方法简单，成本低，但是其具有特异性低、效价低、纯度低等缺陷。因此，低成本的制备高特异性、高效价的抗人肺炎链球菌PspA蛋白抗体就显得十分重要。
技术实现思路
针对
技术介绍
中存在的这些技术问题，本专利技术的目的在于提供识别人肺炎链球菌fam2家族PspA蛋白34-47位以及274-287位氨基酸所组成的两个线性抗原表位的两种抗体及应用该抗体的免疫层析试剂盒。抗人肺炎链球菌fam2家族PspA蛋白抗体，其特征在于：所述抗人肺炎链球菌fam2家族PspA蛋白抗体是分别识别人肺炎链球菌fam2家族PspA蛋白34-47位以及274-287位氨基酸所组成的两个线性抗原表位的两种抗体，所述人肺炎链球菌fam2家族PspA蛋白在GenBank序列号是WP_054380072.1；所述人肺炎链球菌fam2家族PspA蛋白34-47位的14个氨基酸以及274-287位的14氨基酸的氨基酸序列分别为SPQVVEKSSLEKKY及KLLDSLDPEGKTQD；将人肺炎链球菌fam2家族PspA蛋白34-47位的14个氨基酸以及274-287位的14氨基酸的序列分别命名为F2P1及F2F2P2；所述抗人肺炎链球菌fam2家族PspA蛋白抗体是AbF2P1以及AbF2P2。一种基于如前所述的抗人肺炎链球菌fam2家族PspA蛋白抗体所形成的免疫层析试剂盒，其特征在于：所述试剂盒是基于量子点标记技术的免疫层析试剂盒或基于胶体金标记技术的免疫层析试剂盒。作为优选，本专利技术所提供的试剂盒是基于量子点标记技术的免疫层析试剂盒时，所述试剂盒的制备方法是：1)量子点标记抗体AbF2P1溶液：向微量离心管中依次加入0.4nmol羧基水溶性量子点和800nmol碳二亚胺EDC，以MES缓冲液定容为1ml，混合溶液，37℃反应5min后，再加入0.4mg的制备得到的抗体AbF2P1，避光反应2h，加入单端氨基聚乙二醇PEG2000-NH2至终浓度为1％(m/v)，封闭未反应的活化羧基位点，继续避光反应1h；反应后的样品用超滤管离心(截留分子量100k)，6500g离心5min，至体积200ul，将超滤后样品转移至普通EP管内，离心除团聚，得到上部清液以及下部沉淀，10000g条件下离心3min；将上部清液加到分离柱Superdex-200上纯化，待本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种抗人肺炎链球菌fam2家族PspA蛋白抗体，其特征在于：所述抗人肺炎链球菌fam2家族PspA蛋白抗体是分别识别人肺炎链球菌fam2家族PspA蛋白34‑47位以及274‑287位氨基酸所组成的两个线性抗原表位的两种抗体，所述人肺炎链球菌 fam2家族PspA蛋白在GenBank序列号是WP_054380072.1；所述人肺炎链球菌fam2家族 PspA蛋白34‑47位的14个氨基酸以及274‑287位的14氨基酸的氨基酸序列分别为SPQVVEKSSLEKKY及KLLDSLDPEGKTQD；将人肺炎链球菌 fam2家族 PspA蛋白34‑47位的14个氨基酸以及274‑287位的14氨基酸的序列分别命名为F2P1及F2F2P2；所述抗人肺炎链球菌fam2家族PspA蛋白抗体是AbF2P1以及AbF2P2。

【技术特征摘要】
1.一种抗人肺炎链球菌fam2家族PspA蛋白抗体，其特征在于：所述抗人肺炎链球菌fam2家族PspA蛋白抗体是分别识别人肺炎链球菌fam2家族PspA蛋白34-47位以及274-287位氨基酸所组成的两个线性抗原表位的两种抗体，所述人肺炎链球菌fam2家族PspA蛋白在GenBank序列号是WP_054380072.1；所述人肺炎链球菌fam2家族PspA蛋白34-47位的14个氨基酸以及274-287位的14氨基酸的氨基酸序列分别为SPQVVEKSSLEKKY及KLLDSLDPEGKTQD；将人肺炎链球菌fam2家族PspA蛋白34-47位的14个氨基酸以及274-287位的14氨基酸的序列分别命名为F2P1及F2F2P2；所述抗人肺炎链球菌fam2家族PspA蛋白抗体是AbF2P1以及AbF2P2。
2.一种基于如权利要求1所述的抗人肺炎链球菌fam2家族PspA蛋白抗体所形成的免疫层析试剂盒，其特征在于：所述试剂盒是基于量子点标记技术的免疫层析试剂盒或基于胶体金标记技术的免疫层析试剂盒。
3.根据权利要求2所述的抗人肺炎链球菌fam2家族PspA蛋白抗体所形成的免疫层析试剂盒，其特征在于：所述试剂盒是基于量子点标记技术的免疫层析试剂盒时，所述试剂盒的制备方法是：
1）量子点标记抗体AbF2P1溶液：
向微量离心管中依次加入0.4nmol羧基水溶性量子点和800nmol碳二亚胺EDC，以MES缓冲液定容为1ml，混合溶液，37℃反应5min后，再加入0.4mg的制备得到的抗体AbF2P1，避光反应2h，加入单端氨基聚乙二醇PEG2000-NH2至终浓度为1%m/v，封闭未反应的活化羧基位点，继续避光反应1h；反应后的样品用超滤管离心，6500g离心5min，至体积200ul，将超滤后样品转移至普通EP管内，离心除团聚，得到上部清液以及下部沉淀，10000g条件下离心3min；将上部清液加到分离柱Superdex-200上纯化，待上部清液自然流入柱体中，然后用PBS冲洗，用紫外光照射柱体观察样品的位置，待样品开始从下部流出时开始收集，收集1ml后停止收集；将纯化后的样品用超滤管以6500g离心浓缩至200ul后转移至普通EP管内离心除团聚，对普通EP管进行离心的条件是10000g，3min；获取上清后以磷酸盐保存液稀释200倍，4℃保存备用；至此制得量子点标记抗体AbF2P1溶液；
所述MES缓冲液中各组分含量分别是：10.66g/LMES以及0.74g/LEDTA，所述MES缓冲液的pH7.4；
所述磷酸盐保存液的制备方式是称取0.29g磷酸氢二钠、0.0295g磷酸二氢钠、0.2g氯化钠、1g牛血清白蛋白BSA以及0.1gNaN3，溶解于90ml的去离子水中，用1mol/LNaOH调pH至7.3后用去离子水定容至100ml；
2）制备结合垫
将聚酯纤维膜浸入步骤1）所得到的量子点标记抗体AbF2P1溶液中1h，取出，25℃干燥后裁成后规格为4cm×0.6cm/条后，4℃密封保存备用，至此制得结合垫；
3）制备样品垫
取玻璃纤维素膜一张，将玻璃纤维素膜在样品垫处理液中浸泡至少3h，再置于生物安全柜内37℃通风干燥后，剪裁成规格为4cm×2.5cm/条后，即制得样品垫，25℃密封保存；
所述样品垫处理液的制备方式是称取0.29g磷酸氢二钠、0.0295g磷酸二氢钠、0.2g氯化钠、2g牛血清白蛋白BSA、1ml吐温-20、2g蔗糖以及0.5g聚乙烯吡咯烷酮PVP-10，溶解于90ml的去离子水中，用1mol/LNaOH调pH至7.3后用去离子水定容至100ml；
4）制备检测层
将硝酸纤维素膜剪成4cm×4cm大小；将制备得到的抗体AbF2P2和羊抗兔IgG用磷酸盐缓冲液调整至终浓度分别为2.0mg/mL及1.0mg/mL；将稀释好的抗体AbF2P2装入BIODOT划膜仪喷头中，设置1.0μl/cm的量喷于硝酸纤维素膜上，形成检测线；将稀释好的抗兔IgG装入BIODOT划膜仪喷头中，设置1.0μl/cm的量喷于硝酸纤维素膜上作为质控线，质控线与检测线间距为0.7cm；将喷好的硝酸纤维素膜37℃干燥2h，剪裁成4cm×4cm的规格，4℃密封干燥保存；至此制得检测层；
所述磷酸盐缓冲液的制备方式是：称取0.29g磷酸氢二钠、0.0295g磷酸二氢钠以及0.2g氯化钠，溶解于90ml的去离子水中，用1mol/LNaOH调pH至7.3后用去离子水定容至100ml；
5）组装检测卡
5.1）将底板裁剪成4cm×7.3cm大小，备用；
5.2）将吸水滤纸裁剪成4cm×3cm大小，作为吸水垫，备用；
5.3）将步骤5.1）制备得到的底板上的粘性保护膜揭掉，将步骤4）所述的检测层即带有质控线和检测线的硝酸纤维素膜粘贴到底板上，并抹平膜面；
5.4）将步骤5.2）准备好的吸水垫组装到底板上，使吸水垫的左边与检测层右末端有0.2...

【专利技术属性】
技术研发人员：胡征，董俊，杨波，
申请(专利权)人：湖北工业大学，湖北华龙生物制药有限公司，
类型：发明
国别省市：湖北;42