抗人副甲状腺激素相关蛋白的抗体制造技术

本发明专利技术公开了一种抗人副甲状腺激素相关肽的抗体，编码该抗体的ＤＮＡ，包含该ＤＮＡ的重组载体，该载体转化的转化体，制备该抗体的方法，以及该抗体的应用。（*该技术在2017年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及包括抗副甲状腺激素相关蛋白的鼠单克隆抗体可变区(V区)和人抗体恒定区(C区)的人/鼠嵌合抗体，抗副甲状腺激素相关蛋白(PTHrP)的鼠单克隆抗体V区轻链(L链)和重链(H链)的互补决定区移植到人抗体上的人源化抗体，所述抗体的L链和H链，以及含构成所述抗体L链或H链V区的多肽。本专利技术还涉及编码上述抗体尤其是其V区的碱基序列的DNA，以及编码V区的L或H链的DNA。本专利技术进一步涉及含所述DNA的重组载体和所述载体转化的宿主。另外，本专利技术涉及制备抗PTHrP嵌合和人源化抗体的方法。并且本专利技术涉及包括抗PTHrP抗体作为有效成分的高钙血症抑制剂或低磷酸盐血症促进剂的药剂组合物。
技术介绍
与恶性肿瘤有关的高钙血症是在5％到20％的恶性肿瘤病人中发现的严重并发症，它被认为是恶性肿瘤的最终症状，因为如果保留该症状不治疗的话它必然导致死亡。高钙血症的控制极大程度地影响病人的预测和QOL(生命质量)；因此，它将在临床上起重要作用。通常，恶性肿瘤病人的高钙血症粗略地分为HHM(恶性体液性高钙血症)，其基于产生肿瘤的体液性骨重吸收因子，和LOH(局部溶骨性高钙血症)，其基于转移或渗透到骨的肿瘤的局部活性。HHM中，认为骨吸收或骨硬化被促进从而增加钙的流动并产生高钙血症同时伴随肾钙排泄能力的降低(S.Wada和N.Nagata，国际医学，69，644-648)。据认为血清钙浓度超过12毫克/dl时表现出高钙血症的症状；因为其症状厌食(食欲不振)，恶心和呕吐在恶性肿瘤病人的早期是非特异性症状。当高钙血症恶化，由于肾小管远侧的损伤造成水浓缩能力的降低导致多尿，厌食的恶心并伴随由于水摄入缺乏导致的脱水。Moseley，J.M.等发现类似副甲状腺激素(PTH)的物质副甲状腺激素相关蛋白(此后用作“PTHrP”)是一类与恶性肿瘤有关的高钙血症中导致HHM的体液因子美国国家科学院年报(1987)84，5048-5052。因此，分离了编码PTHrP的基因(Suva，L.J.等，科学(1987)237，893)，并且该分析说明了由于基因的交替拼接产生具有139、141和173个氨基酸的三种人PTHrP，这是由于具有完全结构的PTHrP(1-139)的限制性降解各种片段都出现在血液中Baba，H.，临床钙(1995)5，229-223。PTHrP中，N末端13个氨基酸中的8个氨基酸与PTH的相应部位等同，推测其14到34位的氨基酸位点也与PTH类似具有立体结构；因此，PTHrP和PTH至少在N末端区与共同的PTH/PTHrP受体结合Jueppner，H.等，科学(1991)254，1024-1026；Abou-Samra，A-B.等，美国国家科学院年报(1992)89，2732-2736。有报道大量肿瘤组织产生PTHrP，还曾阐述不仅在肿瘤中，胎儿以及成人的各种正常组织也产生PTHrP，包括皮肤、中枢神经系统、子宫、胎盘、哺乳期乳腺、甲状腺、副甲状腺、肾上腺、肝、肾和膀胱Burtis，W.J.，临床化学(1992)38，2171-2183；Stewart，A.F.和Broadus，A.E.，临床内分泌学杂志(1991)71，1410-1414。另外，认为PTHrP对胎儿到新生儿期比在母亲中维持更高浓度的钙的代谢调节起重要作用。目前已知PTH/PTHrP受体主要存在于骨和肾中(C.Shigeno，临床钙(1995)5，355-359)，其通过PTHrP与受体的结合激活多数胞间信号传送系统。其中之一是腺苷酸环化酶，另一个磷脂酶C。腺苷酸环化酶的激活增加了胞间cAMP的浓度从而激活蛋白激酶A。磷脂酶C分解4，5-二磷酸酯酰肌醇产生肌醇1，4，5-三磷酸酯和二酯酰甘油。G蛋白也参与这些信号传送系统Coleman，D.T.等，副甲状腺激素活性的生化机理，“副甲状腺素”(Bilezikian，J.P.等)，Raven Press，NewYork(1994)239页。通过这些信号传导系统，PTHrP导致HHM中观察到的高钙血症、低磷酸盐血症，肾磷酸盐重吸收能力的降低，肾cAMP排泄的增加等。因此，曾经阐述PTHrP与恶性肿瘤有关的高钙血症密切相关。治疗恶性肿瘤相关高钙血症时，曾使用降血钙素、类固醇药物、消炎痛、无机磷酸盐、二磷酸盐等，还曾使用体液置换。然而，这些药物连续使用后发现其作用降低，表现出严重副作用，或其药理作用的缓慢表达；因此十分期望使用具有较高治疗作用和较低副作用的试剂或药物。另一方面，Kukreja，S.C.等报道了一种新的治疗恶性肿瘤相关高钙血症的方法当对人肺或喉癌细胞移植产生高钙血症的无胸腺鼠以抗PTHrP的中和抗血清给药时，血钙浓度和尿cAMP水平降低临床研究杂志(1988)82，1798-1802。Kanji Sato等报道当对移植产生PTHrP的人肿瘤的裸鼠使用抗PTHrP(1-34)抗体给药时，高钙血症缓解，鼠的存活时间显著延长J.Bone & Mine.Res.(1993)8，849-860。另外，日本未审专利申请(公开号为4-228089)公开了抗人PTHrP(1-34)的鼠/人嵌合抗体。鼠单克隆抗体在人体中具有高度免疫原性(有时也用作“抗原性”)，其限制了鼠单克隆抗体在人体中的药物治疗价值。例如，当给人使用鼠抗体给药时，它可能被作为外源物质代谢掉；因此，鼠抗体在人体中的半衰期相对较短，其期望作用就不能有效表达。另外，抗给药的鼠抗体的人抗鼠抗体(HAMA)可能导致对病人不利和危险的免疫反应，例如血清疾病和其它过敏反应。因此，不能频繁地对人使用鼠单克隆抗体给药。为了解决这些问题，已经研究出了降低非人来源的抗体，例如，来源于鼠的单克隆抗体的免疫原性的方法。方法之一是制备嵌合抗体，其中可变区(V区)来源于鼠单克隆抗体，恒定区(C区)来源于合适的人抗体。由于产生的嵌合抗体具有原始鼠抗体的完整可变区，可以认为该嵌合抗体S具有与原始鼠抗体相同的特异性的抗原结合。进一步，这样的嵌合抗体具有的来源于非人动物的氨基酸序列的比例实质上降低；因此，与原始鼠抗体相比，该单克隆抗体同等程度与其抗原结合，而免疫原性降低，但是仍然可能产生对鼠可变区产生一些免疫应答LoBuglio，A.F.等人，美国科学院年报，86，4220-4224，1989。降低鼠抗体的免疫原性的第二个方法还更复杂，但是预期可进一步大大地降低鼠抗体的潜在免疫原性。这种方法中，仅仅鼠抗体可变区的互补决定区(CDR)移植到人抗体可变区从而产生“改造”的人可变区。如果需要，鼠抗体可变区中支持CDR的框架区(FR)的部分氨基酸序列可以移植到人抗体可变区，以使改造的人可变区CDR结构更接近来原始鼠抗体的类似结构。然后，这些人源化的改造的人抗体可变区与人恒定区组合。在最后的改造的人源化抗体中，来源于非人氨基酸序列的部分仅仅是CDR以及很少一部分FR。CDR由高度可变氨基酸序列和不表现任何种属特异性的序列组成。因此，包含鼠CDR的人源化抗体将不再显示比含人CDR的天然存在的人抗体更强的免疫原性。关于人源化抗体，还有如下参考文献Riechmann，L.等，自然，332，323-327，1988；Verhoeye，M.等，科学，239，1534-1536，本文档来自技高网...

【技术保护点】
包含人抗体Ｌ链Ｃ区和小鼠抗人副甲状腺激素相关蛋白单克隆抗体Ｌ链Ｖ区的嵌合Ｌ链。

【技术特征摘要】
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【专利技术属性】
技术研发人员：佐藤功，若原裕二，薮田尚弘，
申请(专利权)人：中外制药株式会社，
类型：发明
国别省市：JP[日本]