【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及包含抗原结合结构域和运送部分且具有比单独存在的抗原结合结构域更长的半衰期的多肽，其中所述运送部分具有抑制抗原结合结构域的抗原结合活性的抑制结构域，用于制备和筛选所述多肽的方法，含有所述多肽的药物组合物，用于制备和筛选能够通过与特定的vl、vh或vhh缔合而使其抗原结合活性受抑制的单结构域抗体的方法，以及包含能够通过与特定的vl、vh或vhh缔合而使其抗原结合活性受抑制的单结构域抗体的融合多肽的文库。
技术介绍
1、因为抗体在血浆中是高度稳定的并且引起很少的不良反应，因此已经作为药物受到关注。其中许多igg型抗体药物已推出，并且目前正在开发大量抗体药物(非专利文献1和2)。
2、迄今为止，针对cd20的利妥昔单抗(rituxan)、针对egfr的西妥昔单抗(cetuximab)、针对her2的曲妥珠单抗(herceptin)等已被批准为使用抗体药物的癌症治疗药物(非专利文献3)。这些抗体分子与他们在癌细胞上表达的抗原相结合，从而通过adcc活性等针对癌细胞发挥细胞毒性。已知这种基于adcc活性等的细胞毒性活性取决于治疗性抗体的靶细胞上所表达的抗原数目(非专利文献4)。因此，从治疗性抗体的效果的观点来看，靶向抗原的高表达水平是优选的。然而，如果抗原(尽管具有高表达水平)是在正常组织中表达，则针对正常细胞发挥基于adcc活性等的细胞毒性。因此，不良反应成为了严重问题。因此，治疗性抗体作为癌症治疗药物所靶向的抗原，优选在癌细胞上特异性表达。例如，针对已知为癌抗原的epcam的抗体分子，作为癌症治疗药物被认为是有
3、在基于adcc活性发挥细胞毒性的抗体药物成功之后，已经报道了发挥强大细胞毒性活性的第二代改良抗体分子作为以下各项的结果：例如，通过从天然人igg1fc区的n连接寡糖去除海藻糖来增强adcc活性(非专利文献6)，或通过经由天然人igg1fc区的氨基酸置换增强与fcγriiia的结合而增强adcc活性(非专利文献7)。也已经报道了改进的抗体分子和小分子抗体作为在机制下发挥不同于如上所述的nk细胞介导的adcc活性的针对癌细胞的细胞毒活性的抗体药物，其中所述改进的抗体分子发挥更强的细胞毒性活性，诸如含有与具有强细胞毒性活性的药物缀合的抗体的抗体药物缀合物(adc)(非专利文献8)，其中所述小分子抗体通过招募t至癌细胞来发挥对癌细胞的细胞毒活性(非专利文献9)。
4、这样的发挥更强细胞毒活性的抗体分子对即使表达不高水平的抗原的癌细胞也发挥细胞毒活性，但也对低水平表达抗原的正常组织发挥细胞毒活性，与癌细胞类似。实际上，与西妥昔单抗(针对egfr的天然的人igg1)相比，egfr-bite(一种针对cd3和egfr的双特异性抗体)能够通过将t细胞招募到癌细胞而对癌细胞发挥强烈的细胞毒活性并发挥抗肿瘤作用。另一方面，还发现通过将egfr-bite施用至食蟹猴出现严重的不良反应，因为egfr也在正常组织中表达(非专利文献10)。此外，由于cd44v6也在正常组织中表达，因此临床上已经发现含有与针对cd44v6的抗体缀合的dm1细胞毒的adc比伐珠单抗dm1细胞毒会引起严重的皮肤毒性和肝毒性，其中所述cd44v6在癌细胞上高表达(非专利文献11)。
5、如上所述，使用能够对低水平表达抗原的癌细胞发挥强细胞毒活性的抗体需要靶抗原以极其癌症特异性的方式表达。然而，考虑到曲妥珠单抗的靶抗原her2或西妥昔单抗的靶抗原egfr也在正常组织中表达，只有有限数量的癌抗原可以以极其癌症特异性的方式表达。因此，尽管可以增强针对癌症的细胞毒性活性，可归因于对正常组织的细胞毒性作用的不良反应可能成为问题。
6、最近，伊匹木单抗，其通过抑制导致癌症免疫抑制的ctla4来增强肿瘤免疫力，已经显示出延长转移性黑素瘤的总体存活率(非专利文献12)。然而，尽管增强了肿瘤免疫力，但由于免疫的全身激活，伊匹木单抗全身性地抑制ctla4并因此引起自身免疫疾病样严重的不良反应(非专利文献13)。
7、同时，已知通过抑制炎症或自身免疫疾病中的炎性细胞因子而发挥治疗作用的抗体药物作为针对癌症以外的疾病的抗体药物(非专利文献14)。已知例如靶向tnf的英利昔单抗(remicade)或阿达木单抗(humira)和靶向il-6r的托珠单抗(actemra)对类风湿性关节炎发挥高治疗效果，然而由于这些细胞因子的全身中和，而将感染性疾病视为不良反应(非专利文献15)。
8、已经开发了各种技术作为适用于第二代抗体药物的技术。例如，已经报道了改善效应子功能、抗原结合能力、药代动力学或稳定性或降低免疫原性风险的技术(非专利文献16)。然而，仍有一些关于允许抗体药物特异性作用于靶组织以解决如上所述的不良反应的技术的报道。所报道的技术包括一种方法，该方法包括：通过在病变部位(诸如癌组织或炎性组织)处表达的蛋白酶切割的接头将抗体与掩蔽肽连接，从而用掩蔽肽掩蔽抗体的抗原结合位点，并抑制该抗体的抗原结合活性；通过该接头的蛋白酶切割使掩蔽肽解离，以便抗体恢复其抗原结合活性，并且变得能够与靶病理组织中的抗原结合(非专利文献17和18以及专利文献1)。
9、引用列表
10、[专利文献]
11、[专利文献1]国际公开no.wo2010/081173
12、[非专利文献]
13、[非专利文献1]monoclonal antibody successes in the clinic.janice mreichert,clark j rosensweig,laura b faden&matthew c dewitz,nat.biotechnol.(2005)23,1073-1078
14、[非专利文献2]the therapeutic antibodies market to 2008.pavlou ak,belsey mj.,eur.j.pharm.biopharm.(2005)59(3),389-396
15、[非专利文献3]monoclonal antibodies:versatile platforms for cancerimmunotherapy.weiner lm,surana r,wang s.,nat.rev.immunol.(2010)10(5),317-327
16、[非专利文献4]differential responses of human tumor cell lines toanti-p185her2 monoclonal antibodies.lewis gd,figari i,fendly b,wong wl,carterp,gorman c,shepard hm,cancer immunol.immunotherapy(1993)37,255-263
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【技术保护点】
1.一种筛选单结构域抗体的方法，所述单结构域抗体的抗原结合活性能够通过与特定VL缔合，与特定VH缔合或与特定VHH缔合而被抑制。
2.根据权利要求1所述的方法，其中，所述方法是筛选单结构域抗体的方法，所述单结构域抗体的抗原结合活性能够通过与特定VL缔合而被抑制，所述方法包括以下步骤：
3.根据权利要求1所述的方法，其中，所述方法是筛选单结构域抗体的方法，所述单结构域抗体的抗原结合活性能够通过与特定VH缔合而被抑制，所述方法包括以下步骤：
4.根据权利要求1所述的方法，其中，所述方法是筛选单结构域抗体的方法，所述单结构域抗体的抗原结合活性能够通过与特定VHH结合而被抑制，所述方法包括以下步骤：
5.根据权利要求1所述的方法，其中所述方法是筛选单结构域抗体的方法，所述单结构域抗体的抗原结合活性能够通过与特定VL缔合而被抑制，所述方法包括以下步骤：
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法是筛选单结构域抗体的方法，所述单结构域抗体的抗原结合活性能够通过与特定VH缔合而被抑制，所述方法包括以下步骤：
7.根
8.制备单结构域抗体的方法，其中所述单结构域抗体的抗原结合活性能够通过与特定VL缔合，与特定VH缔合或与特定VHH缔合而被抑制。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，其中所述方法是用于制备单结构域抗体的方法，所述单结构域抗体的抗原结合活性能够通过与特定的VL缔合而被抑制，所述方法包括以下步骤：
10.根据权利要求8所述的方法，其中所述方法是制备单结构域抗体的方法，所述单结构域抗体的抗原结合活性能够通过与特定的VH缔合而被抑制，所述方法包括以下步骤：
11.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，其中所述方法是用于制备单结构域抗体的方法，所述单结构域抗体的抗原结合活性能够通过与特定的VHH缔合而被抑制，所述方法包括以下步骤：
12.包含多个融合多肽的文库，其中每个融合多肽包含连接至第一缔合维持结构域的单结构域抗体，所述单结构域抗体的抗原结合活性能够通过与特定VL、或特定VH、或特定VHH缔合而被抑制。
13.用于针对融合多肽筛选根据权利要求12所述的文库的方法，所述融合多肽包含其抗原结合活性能够通过与特定VL缔合而被抑制或丧失的单结构域抗体，其抗原结合活性能够通过与特定VH缔合而被抑制或丧失的单结构域抗体，或其抗原结合活性能够通过与特定VHH缔合而被抑制或丧失的单结构域抗体。
14.包含抗原结合结构域和运送部分的多肽，所述运送部分具有抑制抗原结合结构域的抗原结合活性的抑制结构域，并且所述抗原结合结构域比运送部分具有更短的在血液中的半衰期。
15.药物组合物，其包含权利要求14所述的多肽。
16.生产权利要求14所述的多肽的方法。
17.多核苷酸，其编码权利要求14所述的多肽。
18.载体，其包含权利要求17所述的多核苷酸。
19.宿主细胞，其包含权利要求17所述的多核苷酸或权利要求18所述的载体。
20.生产权利要求14所述的多肽的方法，其包括培养权利要求19所述的宿主细胞的步骤。
...【技术特征摘要】
1.一种筛选单结构域抗体的方法，所述单结构域抗体的抗原结合活性能够通过与特定vl缔合，与特定vh缔合或与特定vhh缔合而被抑制。
2.根据权利要求1所述的方法，其中，所述方法是筛选单结构域抗体的方法，所述单结构域抗体的抗原结合活性能够通过与特定vl缔合而被抑制，所述方法包括以下步骤：
3.根据权利要求1所述的方法，其中，所述方法是筛选单结构域抗体的方法，所述单结构域抗体的抗原结合活性能够通过与特定vh缔合而被抑制，所述方法包括以下步骤：
4.根据权利要求1所述的方法，其中，所述方法是筛选单结构域抗体的方法，所述单结构域抗体的抗原结合活性能够通过与特定vhh结合而被抑制，所述方法包括以下步骤：
5.根据权利要求1所述的方法，其中所述方法是筛选单结构域抗体的方法，所述单结构域抗体的抗原结合活性能够通过与特定vl缔合而被抑制，所述方法包括以下步骤：
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法是筛选单结构域抗体的方法，所述单结构域抗体的抗原结合活性能够通过与特定vh缔合而被抑制，所述方法包括以下步骤：
7.根据权利要求1所述的方法，其中，所述方法是筛选单结构域抗体的方法，所述单结构域抗体的抗原结合活性能够通过与特定vhh结合而被抑制，所述方法包括以下步骤：
8.制备单结构域抗体的方法，其中所述单结构域抗体的抗原结合活性能够通过与特定vl缔合，与特定vh缔合或与特定vhh缔合而被抑制。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，其中所述方法是用于制备单结构域抗体的方法，所述单结构域抗体的抗原结合活性能够通过与特定的vl缔合而被抑制，所述方法...
【专利技术属性】
技术研发人员：井川智之，石川广幸，广庭奈绪香，
申请(专利权)人：中外制药株式会社，
类型：发明
国别省市：
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