抗人流感嗜血杆菌P6蛋白抗体及应用该抗体的免疫层析试剂盒制造技术

本发明专利技术涉及抗人流感嗜血杆菌P6蛋白抗体及应用该抗体检测人流感嗜血杆菌的免疫层析试剂盒，抗人流感嗜血杆菌P6蛋白抗体是分别识别人流感嗜血杆菌P6蛋白62-75位以及115-128位氨基酸所组成的两个线性抗原表位的抗体，人流感嗜血杆菌P6蛋白在GenBank序列号是AGH02799.1；人流感嗜血杆菌P6蛋白62-75位以及115-128位的氨基酸序列分别为VLVEGNTDERGTPE及LGHDEAAYSKNRRA。本发明专利技术所提供的两种兔抗人流感嗜血杆菌P6蛋白抗体具有特异性好、纯度高、效价高、制备成本低廉的特点。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于生物医学
，涉及抗人流感嗜血杆菌P6蛋白抗体及应用该抗体检测人流感嗜血杆菌的免疫层析试剂盒。
技术介绍
流感嗜血杆菌(Haemophilusinfluenzae，Hi)是感染人类的一种重要的呼吸道病原微生物，该菌由波兰细菌学家费佛博士在1892年的一次流行性感冒瘟疫中发现的，在随后的时间里被研究者们广泛研究。现仅知人是该病原体的宿主。免疫力较差的老人和儿童为易感人群，特别是5岁以下的婴幼儿。Hi可引发肺炎、结膜炎、中耳炎、脑膜炎和菌血症等，在全球每年至少有300万严重病例发生，可造成患儿致残甚至死亡。Hi分为有荚膜的a、b、c、d、e、f共6个血清型和无荚膜的不可分型流感嗜血杆菌(nontypeableHaemophilusinfluenzae，NTHi)，一度以荚膜b型Hi最为流行。目前我国开展的Hi血清学检查大多也只针对侵袭力较强的荚膜b型。而由于该型菌株荚膜多糖疫苗的成功研发与应用，其流行已被有效控制。近来的研究多显示，在感染Hi的患者中最常见的菌株是NTHi，其分离率已达50％以上。临床上由于Hi与其他呼吸道病原体引起的感染症状类似，因此常难以根据临床表现、x-射线检查等得出结论，确诊往往依赖于实验室诊断。婴幼儿疾病的特点是起病急、转归快，因此敏感、快速、实用的Hi检测对及早进行有效的临床干预具有非常重要的意义。尽管流感嗜血杆菌在全球范围内传播，但可用于实验室诊断的标准化商品试剂的种类极少。目前，Hi感染的诊断方法有血清学检测法，核酸检测法和病原体直接检测法。检测血清中HiIgG、IgA、IgM抗体常用的方法有：微量免疫荧光抗体检测(MIF)，补体结合试验(CF)，重组酶免疫测定(rEIA)，血清补体结合一酶免疫测定试验(SeroCF—EIA)等。然而Hi抗体的检出只能说明该个体感染过Hi，却不能反映体内是否仍有Hi活菌存在，并且血清学特异性抗体检测常需要根据IgM抗体的动态结果进行判断，需要较长的时间。更重要的是，血清学检测的主要检测对象为抗荚膜抗体，而NTHi由于没有荚膜，则会造成漏检。同时，这些技术均存在灵敏度低、操作步骤复杂、需要专业人员操作、重复性差、检测时间长、检测特异性差、成本较高等缺陷，因而难以满足临床的实际需要。核酸检测包括核酸杂交和聚合酶链式反应(PCR)，核酸杂交检测Hi的特异性强，但敏感性不高，主要用于PCR结果的检测、判定，尚未直接用于临床标本的检测；PCR具有较高的敏感性，但PCR实验对实验室有特殊要求，标本处理、扩增和检测要求严格，且易出现假阳性，在我国还不能作为常用的临床诊断方法。病原体检测方法主要为病原分离培养法，将标本接种于添加了V和X因子的巧克力血琼脂培养基上，经24小时培养后，挑取可疑菌落经形态学鉴定后，用Hi鉴定卡、Vilek一60细菌自动分析系统鉴定到种，系统自动进行生物分型。但该法存在操作步骤复杂，细胞培养时间长等明显缺陷，并不适合临床应用。更重要的是，其中的荚膜肿胀实验等仅限于对有荚膜的菌株进行鉴定，而无荚膜型(NTHi)则全部漏检。因此，建立人流感嗜血杆菌特异性抗原的快速诊断方法十分必要。由于人流感嗜血杆菌P6蛋白序列上的高度保守性，使其成为了一个重要的检测标的。因此获得高特异性的抗人流感嗜血杆菌P6蛋白抗体就是一个十分重要的工作。目前，关于抗人流感嗜血杆菌P6蛋白抗体报道得最多的为相应的单克隆抗体及多克隆抗体。单克隆抗体最大的优点就是特异性高，但是制备方法繁琐，生产成本高，限制了其应用。多克隆抗体主要由基因工程表达的P6蛋白免疫家兔等动物制备而成。其制备方法简单，成本低，但是其具有特异性低、效价低、纯度低等缺陷。因此，低成本的制备高特异性、高效价的抗人流感嗜血杆菌P6蛋白抗体就显得十分重要。
技术实现思路
针对
技术介绍
中存在的这些技术问题，本专利技术的目的在于提供识别人流感嗜血杆菌P6蛋白62-75位以及115-128位氨基酸所组成的两个线性抗原表位的两种抗体及应用该抗体的免疫层析试剂盒。抗人流感嗜血杆菌P6蛋白抗体，其特征在于：所述抗人流感嗜血杆菌P6蛋白抗体是分别识别人流感嗜血杆菌P6蛋白62-75位以及115-128位氨基酸所组成的两个线性抗原表位的两种抗体，所述人流感嗜血杆菌P6蛋白在GenBank序列号是AGH02799.1；所述人流感嗜血杆菌P6蛋白62-75位的14个氨基酸以及115-128位的14氨基酸的氨基酸序列分别为VLVEGNTDERGTPE及LGHDEAAYSKNRRA；将人流感嗜血杆菌P6蛋白62-75位的14个氨基酸以及115-128位的14氨基酸的序列分别命名为P6A及P6B；所述抗人流感嗜血杆菌P6蛋白抗体是AbP6A以及AbP6B。一种基于如前所述的抗人流感嗜血杆菌P6蛋白抗体所形成的免疫层析试剂盒，其特征在于：所述试剂盒是基于量子点标记技术的免疫层析试剂盒或基于胶体金标记技术的免疫层析试剂盒。作为优选，本专利技术所提供的试剂盒是基于量子点标记技术的免疫层析试剂盒时，所述试剂盒的制备方法是：1)量子点标记抗体AbP6A溶液：向微量离心管中依次加入0.4nmol羧基水溶性量子点和800nmol碳二亚胺EDC，以MES缓冲液定容为1ml，混合溶液，37℃反应5min后，再加入0.34mg的制备得到的抗体AbP6A，避光反应2h，加入单端氨基聚乙二醇PEG2000-NH2至终浓度为1％(m/v)，封闭未反应的活化羧基位点，继续避光反应1h；反应后的样品用超滤管离心(截留分子量100k)，6500g离心5min，至体积200ul，将超滤后样品转移至普通EP管内，离心除团聚，得到上部清液以及下部沉淀，10000g条件下离心3min；将上部清液加到分离柱Superdex-200上纯化，待上部清液自然流入柱体中，然后用PBS冲洗，用紫外光照射柱体观察样品的位置，待样品开始从下部流出时开始收集，收集1ml后停止收集；将纯化后的样品用超滤管(截留分子量100k)以6500g离心浓缩至200ul后转移至普通EP管内离心除团聚，对普通EP管进行离心的条件是10000g，3min；获取上清后以磷酸盐保存液稀释200倍，4℃保存备用；至此制得量子点标记抗体AbP6A溶液；所述MES缓冲液中各组分含量分别是：10.66g/LMES以及0.74g/LEDTA，所述MES缓冲液的pH7.4；所述磷酸盐保存液的制备方式是称取0.29g磷酸氢二钠、0.0295g磷酸二氢钠、0本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种抗人流感嗜血杆菌P6蛋白抗体，其特征在于：所述抗人流感嗜血杆菌P6蛋白抗体是分别识别人流感嗜血杆菌P6蛋白62‑75位以及115‑128位氨基酸所组成的两个线性抗原表位的两种抗体，所述人流感嗜血杆菌P6蛋白在GenBank序列号是AGH02799.1；所述人流感嗜血杆菌P6蛋白62‑75位的14个氨基酸以及115‑128位的14氨基酸的氨基酸序列分别为VLVEGNTDERGTPE及LGHDEAAYSKNRRA；将人流感嗜血杆菌P6蛋白62‑75位的14个氨基酸以及115‑128位的14氨基酸的序列分别命名为P6A及P6B；所述抗人流感嗜血杆菌P6蛋白抗体是AbP6A以及AbP6B。

【技术特征摘要】
1.一种抗人流感嗜血杆菌P6蛋白抗体，其特征在于：所述抗人流感嗜血杆菌P6蛋白抗体是分别识别人流感嗜血杆菌P6蛋白62-75位以及115-128位氨基酸所组成的两个线性抗原表位的两种抗体，所述人流感嗜血杆菌P6蛋白在GenBank序列号是AGH02799.1；所述人流感嗜血杆菌P6蛋白62-75位的14个氨基酸以及115-128位的14氨基酸的氨基酸序列分别为VLVEGNTDERGTPE及LGHDEAAYSKNRRA；将人流感嗜血杆菌P6蛋白62-75位的14个氨基酸以及115-128位的14氨基酸的序列分别命名为P6A及P6B；所述抗人流感嗜血杆菌P6蛋白抗体是AbP6A以及AbP6B。
2.一种基于如权利要求1所述的抗人流感嗜血杆菌P6蛋白抗体所形成的免疫层析试剂盒，其特征在于：所述试剂盒是基于量子点标记技术的免疫层析试剂盒或基于胶体金标记技术的免疫层析试剂盒。
3.根据权利要求2所述的抗人流感嗜血杆菌P6蛋白抗体所形成的免疫层析试剂盒，其特征在于：所述试剂盒是基于量子点标记技术的免疫层析试剂盒时，所述试剂盒的制备方法是：
1）量子点标记抗体AbP6A溶液：
向微量离心管中依次加入0.4nmol羧基水溶性量子点和800nmol碳二亚胺EDC，以MES缓冲液定容为1ml，混合溶液，37℃反应5min后，再加入0.34mg的制备得到的抗体AbP6A，避光反应2h，加入单端氨基聚乙二醇PEG2000-NH2至终浓度为1%m/v，封闭未反应的活化羧基位点，继续避光反应1h；反应后的样品用超滤管离心，6500g离心5min，至体积200ul，将超滤后样品转移至普通EP管内，离心除团聚，得到上部清液以及下部沉淀，10000g条件下离心3min；将上部清液加到分离柱Superdex-200上纯化，待上部清液自然流入柱体中，然后用PBS冲洗，用紫外光照射柱体观察样品的位置，待样品开始从下部流出时开始收集，收集1ml后停止收集；将纯化后的样品用超滤管以6500g离心浓缩至200ul后转移至普通EP管内离心除团聚，对普通EP管进行离心的条件是10000g，3min；获取上清后以磷酸盐保存液稀释200倍，4℃保存备用；至此制得量子点标记抗体AbP6A溶液；
所述MES缓冲液中各组分含量分别是：10.66g/LMES以及0.74g/LEDTA，所述MES缓冲液的pH7.4；
所述磷酸盐保存液的制备方式是称取0.29g磷酸氢二钠、0.0295g磷酸二氢钠、0.2g氯化钠、1g牛血清白蛋白BSA以及0.1gNaN3，溶解于90ml的去离子水中，用1mol/LNaOH调pH至7.3后用去离子水定容至100ml；
2）制备结合垫
将聚酯纤维膜浸入步骤1）所得到的量子点标记抗体AbP6A溶液中1h，取出，25℃干燥后裁成后规格为4cm×0.6cm/条后，4℃密封保存备用，至此制得结合垫；
3）制备样品垫
取玻璃纤维素膜一张，将玻璃纤维素膜在样品垫处理液中浸泡至少3h，再置于生物安全柜内37℃通风干燥后，剪裁成规格为4cm×2.5cm/条后，即制得样品垫，25℃密封保存；
所述样品垫处理液的制备方式是称取0.29g磷酸氢二钠、0.0295g磷酸二氢钠、0.2g氯化钠、2g牛血清白蛋白BSA、1ml吐温-20、2g蔗糖以及0.5g聚乙烯吡咯烷酮PVP-10，溶解于90ml的去离子水中，用1mol/LNaOH调pH至7.3后用去离子水定容至100ml；
4）制备检测层
将硝酸纤维素膜剪成4cm×4cm大小；将制备得到的抗体AbP6B和羊抗兔IgG用磷酸盐缓冲液调整至终浓度分别为2.0mg/mL及1.0mg/mL；将稀释好的抗体AbP6B装入BIODOT划膜仪喷头中，设置1.0μl/cm的量喷于硝酸纤维素膜上，形成检测线；将稀释好的抗兔IgG装入BIODOT划膜仪喷头中，设置1.0μl/cm的量喷于硝酸纤维素膜上作为质控线，质控线与检测线间距为0.7cm；将喷好的硝酸纤维素膜37℃干燥2h，剪裁成4cm×4cm的规格，4℃密封干燥保存；至此制得检测层；
所述磷酸盐缓冲液的制备方式是：称取0.29g磷酸氢二钠、0.0295g磷酸二氢钠以及0.2g氯化钠，溶解于90ml的去离子水中，用1mol/LNaOH调pH至7.3后用去离子水定容至100ml；
5）组装检测卡
5.1）将底板裁剪成4cm×7.3cm大小，备用；
5.2）将吸水滤纸裁剪成4cm×3cm大小，作为吸水垫，备用；
5.3）将步骤5.1）制备得到的底板上的粘性保护膜揭掉，将步骤4）所述的检测层即带有质控线和检测线的硝酸纤维素膜粘贴到底板上，并抹平膜面；
5.4）将步骤5.2）准备好的吸水垫组装到底板上，使吸水垫的左边与检测层右末端有0.2cm的重叠，吸水垫的右边缘则与底板的右边缘对齐粘好并抹平；再将步...

【专利技术属性】
技术研发人员：胡征，董俊，杨波，
申请(专利权)人：湖北工业大学，湖北华龙生物制药有限公司，
类型：发明
国别省市：湖北;42