一种乳腺癌特异性CTLs的制备方法技术

本发明专利技术涉及一种乳腺癌特异性CTLs的制备方法，属于生物制药技术领域，该制备方法通过乳腺癌患者自体癌组织分离出乳腺癌干细胞，然后利用细胞融合技术，将患者自体的DC细胞与患者自体乳腺癌干细胞融合，获得兼具乳腺癌干细胞特性、DC细胞抗原传递性的融合细胞，再刺激产生大量可以特异杀伤乳腺癌干细胞的杀伤性T细胞CTLs。将获得的特异杀伤乳腺癌干细胞的CTLs回输患者体内，可以达到杀伤乳腺癌干细胞，防止复发、转移的效果。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于生物制药
，，更具体的说，涉及到一种乳腺癌特异性CTLs的制备方法。
技术介绍
乳腺癌是全世界女性最常见的癌病之一，占新发癌症的第三位，占因癌症导致死亡的第五位，发病率占全身各种恶性肿瘤的7％～10％，占全部女性恶性肿瘤总数21％。乳腺癌每年约有7.9万新病例，上升趋势明显，已经成为当前严重威胁女性健康和生命的一类疾病。研究乳腺癌的防治对策是摆在全世界科学工作者面前的重要任务。目前，乳腺癌治疗主要有手术治疗、放射治疗和化学治疗三种方法。手术治疗，对于较早期的乳腺癌来说，是一种根治的方法，对较晚期的乳腺癌则常作为一种姑息性的治疗手段，且术后患者多伴有一定的并发症，严重影响生存质量。化疗，由于目前常用的药物选择性和特异性差，在杀伤癌细胞的同时会杀伤正常的组织细胞，毒副作用强，尤其是消化功能受损和骨髓造血功能受抑制等反应最为明显，往往使乳腺癌患者因反应严重而难以接受化疗或不能坚持完成整个疗程。放疗也存在着明显的毒副反应，且仅对年青且局部复发相对高危者的疗效较好，而对老年患者和任何年龄局部复发的高危人群作用差。由于传统治疗方式的局限性、风险大、耗资高、药物的选择性差、毒副作用强、增加病人痛苦等缺点，研究者致力于寻找更加高效、低毒、特异性强的治疗方法。多项实验及临床研究均提示机体的免疫系统具有特异性清除肿瘤的作用。免疫疗法成为肿瘤治疗重要手段之一。其最大优点是针对肿瘤细胞，最具有特异性，不损害正常细胞，治疗效果为全身性，适用于治疗早期和晚期的患者。免疫治疗通过调节机体抗肿瘤各环节(免疫系统、神经内分泌系统、癌基因与抑癌基因、血管生成、精神因素等)的平衡，达到控制肿瘤或减轻治疗相关副作用的目的。因此，乳腺癌治疗正从传统的治疗方式向针对机制的多环节作用的高效、低毒、特异性强新型治疗模式发展。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题在于：提供一种乳腺癌特异性CTLs的制备方法，解决现有免疫疗法治疗乳腺癌的过程中，无法快速、大量的获得杀伤作用强、体内存活时间长的免疫治疗效应细胞的问题。本专利技术解决上述问题的技术方案为：提供一种乳腺癌特异性CTLs的制备方法，包括如下步骤：S100、融合细胞的制备：从乳腺癌患者自体癌组织分离出乳腺癌干细胞，使用乳腺癌患者自体的外周血体外培养获得成熟DC细胞，将所述DC细胞与所述乳腺癌干细胞融合得到融合细胞；S200、培养乳腺癌特异性CTLs：使用乳腺癌患者自体的外周血体外培养获得T细胞，将所述T细胞与所述融合细胞按照10-20∶1的比例进行混合，共同培养获得乳腺癌特异性CTLs。在本专利技术提供的乳腺癌特异性CTLs的制备方法中，所述步骤S100中还包括：S101、乳腺癌干细胞的分离：将乳腺癌患者自体癌组织剪碎，经过胶原酶消化、过滤、悬浮、混合血清、离心获得乳腺癌干细胞；S102、DC细胞的体外培养：从乳腺癌患者自体的外周血中分离外周血单个核细胞，所述外周血单个核细胞在含5-10％灭活的正常人AB血清的1640培养基里培养30-90min，吸去悬浮细胞，贴壁细胞用含800-2000U/mlGM/CSF、500-1000U/mlIL-4和5％正常人AB血清的1640培养基中培养5-7天，获得有树突形状的成熟DC细胞；S103、细胞融合：将所述DC细胞与所述乳腺癌干细胞按照5-20∶1的比例进行混合，离心去掉上清液，加入在37℃预温的50％聚乙二醇1ml作用2-3分钟，使肿瘤细胞与DC融合，用不含血清1640培养液轻轻混匀，离心去掉含有聚乙二醇上清液，获得融合细胞。在本专利技术提供的乳腺癌特异性CTLs的制备方法中，所述步骤S103之后还包括：S104、融合细胞培养：所述融合细胞置于含有500-2000U/mlGM-CSF和含有10％自体血清的AIM-V培养液中，培养5-6天，根据细胞培养的状况，进行半量换液；S105、细胞收集：收集培养获得的融合细胞，经200Gy辐照后备用。在本专利技术提供的乳腺癌特异性CTLs的制备方法中，所述步骤S200中还包括：S201、T细胞的体外培养：从乳腺癌患者自体的外周血中分离外周血单个核细胞，所述外周血单个核细胞在培养瓶中用纤粘连蛋白来源的短肽包被过夜，补加100-1000IU/mlIFN-γ，置于37℃、5％CO2浓度、饱和水蒸气环境中培养；24小时后补加1000IU/mlIL-2、100-250ng/mlCD3mAb、5-10ug/mlCD28mAb；每2-3天补加含5％自体血浆、100-200IU/ml庆大霉素、1000IU/mlIL-2、5-20ug/mlCD28mAb的AIM-V完全培养液；S202、乳腺癌特异性CTL的获得：所述T细胞培养至第7天时，将所述T细胞与所述融合细胞按10-20∶1的比例进行混合，共同培养，每2-3天补加含5％自体血浆、100-200IU/ml庆大霉素、1000IU/mlIL-2、5-20ug/mlCD28mAb、500-2000IU/mlGM-CSF的AIM-V完全培养液，第12-14天收获细胞并计数。实施本专利技术，具有如下有益效果：使用兼具乳腺癌干细胞特性、DC细胞抗原传递性的融合细胞刺激T细胞，产生可以特异杀伤乳腺癌干细胞的CTLs，获得的CTLs对乳腺癌细胞的凋亡有明显的促进作用。附图说明为了更清楚地说明本专利技术实施例中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本专利技术的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。图1为本专利技术乳腺癌特异性CTLs的制备方法较佳实施例的流程图；图2为本专利技术乳腺癌特异性CTLs的制备方法的操作流程图；图3为乳腺癌MCF7细胞凋亡实验的结果图。具体实施方式下面将结合附图对本专利技术的实施例进行具体描述。杀伤性T细胞(CTLs：CytotoxicT-celllymphocytes)为一种特异T细胞，专门分泌各种细胞因子参与免疫作用。对某些病毒、肿瘤细胞等抗原物质具有杀伤作用，与自然杀伤细胞构成机体抗病毒、抗肿瘤免疫的重要防线。使用CTLs特异性清除肿瘤的免疫疗法在治疗过程中最关键的是要获得大量杀伤作用强、体内存活时间长的免疫治疗效应细胞。本专利技术的主要创新点在于：通过乳腺癌患者自体癌组织分离出乳腺癌干细胞，然后利用细胞融合技术，将患者自体的树突细胞(DC细胞:DendriticCell)与患者自体乳腺癌干细胞融合，获得兼具乳腺癌干细胞特性、DC细胞抗原传递性的融合细胞，再刺激产生大量可以特异杀伤乳腺癌干细胞的杀伤性T细胞CTLs。将获得的特异杀伤乳腺癌干细胞的CTLs回输患者体内，可以达到杀伤乳腺癌干细胞，防止复发、转移的效果。图1为本专利技术乳腺癌特异性CTLs的制备方法较佳实施例的流程图，如图1所示，制备方法包括如下步骤：S100、融合细胞的制备：从乳腺癌患者自体癌组织分离出乳腺癌干细胞，使用乳腺癌患者自体的外周血体外培养获得成熟DC细胞，将所述DC细胞与所述乳腺癌干细胞融合得到融合细胞；S200、培养乳腺癌特异性CTLs：使用乳腺癌患者自体的外周血体外培养获得T细胞，将所述T细胞与所述融合细胞按照10-20∶1的比例进行混合，共同培养获得乳腺癌特本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种乳腺癌特异性CTLs的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：S100、融合细胞的制备：从乳腺癌患者自体癌组织分离出乳腺癌干细胞，使用乳腺癌患者自体的外周血体外培养获得成熟DC细胞，将所述DC细胞与所述乳腺癌干细胞融合得到融合细胞；S200、培养乳腺癌特异性CTLs：使用乳腺癌患者自体的外周血体外培养获得T细胞，将所述T细胞与所述融合细胞按照10‑20∶1的比例进行混合，共同培养获得乳腺癌特异性CTLs。

【技术特征摘要】
1.一种乳腺癌特异性CTLs的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：S100、融合细胞的制备：从乳腺癌患者自体癌组织分离出乳腺癌干细胞，使用乳腺癌患者自体的外周血体外培养获得成熟DC细胞，将所述DC细胞与所述乳腺癌干细胞融合得到融合细胞；S200、培养乳腺癌特异性CTLs：使用乳腺癌患者自体的外周血体外培养获得T细胞，将所述T细胞与所述融合细胞按照10-20∶1的比例进行混合，共同培养获得乳腺癌特异性CTLs。2.根据权利要求1所述的乳腺癌特异性CTLs的制备方法，其特征在于，所述步骤S100中还包括：S101、乳腺癌干细胞的分离：将乳腺癌患者自体癌组织剪碎，经过胶原酶消化、过滤、悬浮、混合血清、离心获得乳腺癌干细胞；S102、DC细胞的体外培养：从乳腺癌患者自体的外周血中分离外周血单个核细胞，所述外周血单个核细胞在含5-10％灭活的正常人AB血清的1640培养基里培养30-90min，吸去悬浮细胞，贴壁细胞用含800-2000U/mlGM/CSF、500-1000U/mlIL-4和5％正常人AB血清的1640培养基中培养5-7天，获得有树突形状的成熟DC细胞；S103、细胞融合：将所述DC细胞与所述乳腺癌干细胞按照5-20∶1的比例进行混合，离心去掉上清液，加入在37℃预温的50％聚乙二醇1ml作用2-3分钟，使肿瘤细胞与DC融合，用不含血清1640培养液轻轻混匀，离心去掉含有聚乙二醇上清液，获得融合细胞。3.根据权利要求2所述的乳腺癌...

【专利技术属性】
技术研发人员：张明，肖洪宝，
申请(专利权)人：深圳中健生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：广东;44