用于检测短串联重复序列的引物、试剂盒及方法技术

本发明专利技术属于基因工程技术领域，公开了一种用于检测短串联重复序列的引物组合、含有该引物组合的试剂盒以及用于检测短串联重复序列的方法。本发明专利技术选取了中国人群遗传多态性高的基因座，更适用于中国人群；本发明专利技术选择的串联重复单位为四个、五个或六个，能够有效降低滑移峰比例，检测结果的准确性更高；本发明专利技术采用荧光标记复合扩增系统进行扩增，扩增产物可在同一毛细管中进行电泳，实现了对全部基因座同时进行检测分析；本发明专利技术采用技术成熟的荧光标记物进行荧光标记，成本低；本发明专利技术的检测方法特异性好，可用于个体识别、亲缘鉴定、群体遗传学研究等定性分析，也可用于造血干细胞移植后嵌合率检测等定性分析。

【技术实现步骤摘要】
用于检测短串联重复序列的引物、试剂盒及方法
本专利技术涉及基因工程
，具体涉及用于检测短串联重复序列的引物、试剂盒及方法。
技术介绍
短串联重复序列(shorttandemrepeats，STR)是一类广泛存在于人类基因组中、核心序列为2～6个碱基的DNA串联重复序列。短串联重复序列在不同个体间具有极高的识别率，据统计，无关个体间12个STR位点完全相同的概率为10-14，同胞之间完全相同的概率为10-4，是识别不同个体DNA的有力指标，且这种差异在遗传过程中遵循孟德尔遗传规律。因此，STR扩增检测技术被广泛用于个体识别、亲缘鉴定、群体遗传学研究和嵌合率检测等方面。随着毛细管电泳设备的高度自动化，大量的STR位点被各大人类身份认定的标准所定义(欧洲STR标准ESS，国际刑警组织采用的DNA标准基因座ISSOL，美国联邦调查局的联合DNA索引系统CODIS等)，越来越多的研究学者投入该领域对其进行开发性研究。目前，国内在进行STR检测时多依赖于进口的STR试剂盒。大量的研究报道，短串联重复序列基因座的遗传多态性在种族之间存在一定的差异。有鉴于此，迫切需要研发出更多适用于中国人群并能够与现代普遍使用的检测仪器相适应的STR检测方法和试剂盒。
技术实现思路
本专利技术针对现有技术中存在的上述缺陷，针对中国人群遗传多态性高的基因座，重新设计了适于检测中国人群短串联重复序列的引物以及检测方法。本专利技术的检测方法快速、简便、准确、直观，且实验成本低。为此，本专利技术一方面提供了一种用于检测短串联重复序列的引物组合，其由序列1-36所示的引物组成，分别针对基因座THO1、D21S11、D2S1338、PentaE、D5S818、D13S317、D7S820、D16S539、CSF1PO、Amelogenin、vWA、D8S1179、TPOX、FGA、D6S1043、D12S391、D10S1248、PentaD进行检测。本专利技术检测的短串联重复序列除了包含了人类遗传多态性高的基因座之外，还包含了中国人群遗传多态性高的基因座D2S1338、D12S391、D6S1043和D10S1248。这几个基因座均属于中国人群中高鉴别、高杂合度、高信息量的基因座。因此，本专利技术所设计的检测方法更适用于中国人群，有利于该技术的推广与应用。除此之外，本专利技术选择的STR基因座的串联重复单位为四个、五个或六个，能够有效降低滑移峰比例，获得的检测结果准确性更高。在本专利技术优选的实施方案中，该引物组合进一步由第1-4组引物组成，其中第1组由序列1-8所示的引物组成，针对基因座THO1、D21S11、D2S1338、PentaE进行检测，第2组由序列9-18所示的引物组成，针对基因座D5S818、D13S317、D7S820、D16S539、CSF1PO进行检测，第3组由序列19-28所示的引物组成，针对基因座Amelogenin、vWA、D8S1179、TPOX、FGA进行检测，第4组由序列29-36所示的引物组成，针对基因座D6S1043、D12S391、D10S1248、PentaD进行检测。在本专利技术进一步优选的实施方案中，检测每个基因座的引物对中有一条引物进行荧光染料标记，以用于毛细管电泳检测，进而得出其等位基因型别和大小。同时，上述4组引物分别采用4种不同颜色的荧光染料进行标记，分别标记于引物的5’端。在本专利技术更加优选的实施方案中，第1组引物采用蓝色荧光染料标记，荧光标记物为6-FAM，第2组引物采用绿色荧光染料标记，荧光标记物为HEX，第3组引物采用黄色荧光染料标记，荧光标记物为TAMRA，第4组引物采用红色荧光染料标记，荧光标记物为ROX，同时选用橙色荧光标记作为内标，荧光标记物为SIZ。由此，每组扩增后的产物和橙色荧光标记的内标混合后即可在同一毛细管中进行电泳，实现了对18个STR基因座同时进行检测分析。采用6-FAM、HEX、TAMRA、ROX和SIZ五种荧光标记物进行荧光标记，荧光素标记技术成熟，成本低。但是，本专利技术采用的荧光标记物并不限于此，本领域技术人员可以根据实际情况选择其他可替换的荧光标记物。在本专利技术提供的检测方法中，18个STR基因座采用的特异性扩增引物序列信息如表1所示。表1、本专利技术检测短串联重复序列的引物情况表在本专利技术提供的检测方法中，可以将18个基因座的所有引物混合在一起，在一个PCR反应中完成这18个基因座等位基因的复合扩增。因此，该复合扩增体系操作简单、效率高，成本低，更有利于该方法的推广与应用。此外，在本专利技术优选的实施方案中，每个引物的浓度为0.05-0.4μmol/L，更加优选为0.06-0.2μmol/L。在一些具体的实施方式中，该18个基因座的引物浓度如表2所示。表2、本专利技术检测短串联重复序列的引物浓度表本专利技术另一方面提供了一种用于检测短串联重复序列的试剂盒，其包含本专利技术所述的引物组合。本专利技术另一方面提供了本专利技术所述的引物组合在制备用于检测短串联重复序列的试剂盒中的应用。本专利技术再一方面提供了本专利技术所述的引物组合，或者本专利技术所述的试剂盒在检测短串联重复序列中的应用。本专利技术最后一方面提供了一种检测短串联重复序列的方法，其包含以下步骤：1、获取待测样品DNA。2、采用本专利技术所述的引物组合，或采用本专利技术所述的试剂盒，以步骤1中获取的DNA为模板，进行PCR扩增，优选采用荧光标记复合扩增系统进行扩增。3、对步骤2中获取的PCR扩增产物进行检测和分型分析，获得待测样品各基因座的型别，其中优选采用毛细管电泳检测。在本专利技术提供的检测方法中，扩增所采用的PCR扩增体系包括缓冲体系。该缓冲体系包括：KCl，Tris-HCl，MgCl2、dNTP、甘油和吐温20，其中dNTP为四种脱氧核糖核苷酸(dATP、dTTP、dCTP和dGTP)等摩尔混合物。该扩增方法中所用的DNA聚合酶为TaqDNA聚合酶，可选择热启动DNA聚合酶、抗体封闭修饰和/或化学修饰的DNA聚合酶。在本专利技术进一步提供的实施例中，本专利技术扩增所用的PCR扩增体系包括如下含量的各成分：50mmol/LKCl，20mmol/LTris-HCl，2.5mmol/LMgCl2、0.3mmol/LdNTP(每种脱氧核糖核苷酸的浓度均为0.3mmol/L)、3.2％甘油和0.07％吐温20、100units/mLTaqDNA聚合酶、0.05μmol/L-0.4μmol/L的引物。扩增体积为10μL-50μL，优选为10μL-25μL。在本专利技术提供的检测方法中，PCR扩增所采用的程序分为三个步骤：第一步：95℃，2min-5min；第二步：95℃，20s；58℃-60℃，20s-2min30s；68℃-72℃，30s-2min；25-30个循环；第三步：68℃-72℃，25min-45min。在本专利技术进一步优选的实施方案中，本专利技术PCR扩增所用的程序具体为：第一步：95℃，5min；第二步：95℃，20s；60℃，2min；68℃，1min；25个循环；第三步：68℃，25min。在本专利技术提供的检测方法中，当采用带有荧光标记的引物进行扩增时，扩增获得的产物也带有荧光标记物。在毛细管电泳过程中，所带有的荧光标记物可以在激光激发下发出荧光信号，该荧光信号可被测序仪(如373本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于检测短串联重复序列的引物组合，其由序列1‑36所示的引物组成，分别针对基因座THO1、D21S11、D2S1338、PentaE、D5S818、D13S317、D7S820、D16S539、CSF1PO、Amelogenin、vWA、D8S1179、TPOX、FGA、D6S1043、D12S391、D10S1248、PentaD进行检测。

【技术特征摘要】
1.一种用于检测短串联重复序列的引物组合，其由序列1-36所示的引物组成，分别针对基因座THO1、D21S11、D2S1338、PentaE、D5S818、D13S317、D7S820、D16S539、CSF1PO、Amelogenin、vWA、D8S1179、TPOX、FGA、D6S1043、D12S391、D10S1248、PentaD进行检测。2.根据权利要求1所述的引物组合，其进一步由第1-4组引物组成，其中第1组由序列1-8所示的引物组成，针对基因座THO1、D21S11、D2S1338、PentaE进行检测，第2组由序列9-18所示的引物组成，针对基因座D5S818、D13S317、D7S820、D16S539、CSF1PO进行检测，第3组由序列19-28所示的引物组成，针对基因座Amelogenin、vWA、D8S1179、TPOX、FGA进行检测，第4组由序列29-36所示的引物组成，针对基因座D6S1043、D12S391、D10S1248、PentaD进行检测。3.根据权利要求2所述的引物组合，其中检测每个基因座的引物对中有一条引物进行荧光染料标记，并且上述4组引物分别采用4种不同颜色的荧光染料进行标记，分别标记于引物的5’端。4.根据权利要求3所述的引物组合，其中第1组引物采用蓝色荧光染料标记，荧光标记物为6-FAM，第2组引物采用绿色荧光染料标记，荧光标记物为HEX，第3组引物采用黄色荧光染料标记，荧光标记物为TAMRA，第4组引物采用红色荧光染料标记，荧光标记物为ROX。5.根据权利要求4所述的引物组合，其中每条引物的浓度为0.05-0.4μmo...

【专利技术属性】
技术研发人员：郑仲征，冀丽军，何贵伦，
申请(专利权)人：上海荻硕贝肯医学检验所有限公司，上海荻硕贝肯生物科技有限公司，上海荻硕贝肯生物技术有限公司，深圳荻硕贝肯精准医学有限公司，
类型：发明
国别省市：上海,31